Механистический Взгляд на развитие TNBS-опосредованного кишечного фиброза и оценки ингибиторных эффектов рапамицина
1Department of Molecular and Cellular Physiology,Albany Medical College, 2The IBD Center, Division of Gastroenterology, Department of Medicine,Albany Medical College, 3Department of Geriatrics, School of Medicine and Health Science,University of North Dakota, 4Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics,Albany Medical College
Summary
В этом исследовании мы описываем детальную процедуру опосредованного TNBS кишечного фиброза, который проявляет сравнимый патофизиология с фиброзом Крона. Мы также обсуждаем этот подход в свете рапамицина, облегчающих ингибирующее воздействие на кишечный фиброз.
Abstract
Были проведены значительные исследования для понимания эффективного управления кишечным фиброзом. Однако отсутствие лучшего знания фиброза препятствует разработке профилактического препарата. В первую очередь, найти подходящую модель животных является сложной задачей в понимании механизма Крона связанных кишечной фиброзной патологии. Здесь мы приняли эффективный метод, при котором химическое воздействие TNBS на прямой кишки мышей приводит к значительно глубокой язве и хроническому воспалению, а у мышей затем хронически развивается кишечный фиброз. Кроме того, мы описываем технику, где инъекция рапамицина показывает ингибирующее воздействие на TNBS-опосредованный фиброз в модели мыши. Для оценки основного механизма фиброза мы методично обсуждаем процедуру очистки клеток Cx3Cr1 от ламинированной проприии обработанных ТНБС и контролирующих мышей. Этот подробный протокол будет полезен для исследователей, которые изучают механизм фиброза и проложить путь, чтобы найти лучшее терапевтическое изобретение для Крона связанных кишечного фиброза.
Introduction
Дисрегуляция иммунного гомеостаза в кишечнике приводит к патогенное воспаление и, как известно, вызывает воспалительные заболевания кишечника (IBD)1,2. Кишечный фиброз является хроническим следствием воспалительных заболеваний кишечника (IBDs), таких как болезнь Крона (CD)3. Необратимая патофизиология CD включает в себя кишечную строгость или стеноз фиброза, который ограничивает варианты лечения, и без лекарств в настоящее время, единственным лечением является хирургия. В конечном счете, разработка эффективных методов лечения для борьбы с неуместным воспалением очень необходима для изучения механизма CD, и это приведет нас на шаг ближе к этому.
Различные модели генетических мышей доступны для изучения IBD в том числе IL10 KO, SAMP/ Yit и приемных CD45иRB высокой передачи клеток в SCID мышей4,5,6. Здесь мы показываем процедуру фиброза, опосредованного ТНБС, в мышиной модели CD, которая сравнима с патологией фиброза крона человека. Модель, индуцированная TNBS, имеет определенные преимущества. Эта модель технически проста; болезнь начала быстро, недорого, и может широко использоваться в различных животных (например, мышь, крыса и морская свинка7). Совместное управление этанолом и TNBS (2,4,6-тринитробензен сульфоновой кислоты) резко повреждает кишечный барьер и подвергает белка толстой кишки ткани TNBS и вызывают существенные иммунологические ответы8,9. Повторное воздействие TNBS приводит к чрезмерной реактивной процесс ремонта в ответ на воспаление и травмы, и развивается фиброзная реакция в кишечнике. Таким образом, TNBS-индуцированной фиброз модель служит очень убедительной моделью для изучения Крона связанных кишечного фиброза.
Кроме того, мононуклеарные фагоциты являются основными клетками, которые арбитр врожденного иммунного ответа на патогенез и травмы в кишечнике10,11,12,13. Чтобы прояснить клеточный механизм и установить роль моноядерных фагоцитов Cx3Cr1в модели фиброзного ТНБС, мы показываем процедуру очищения мононуклеарных фагоцитов. Анализклеток Cx3Cr1 является важным шагом для оценки воспалительных маркеров и определения сопутствующей механизма для кишечного фиброза. В совокупности, эта подробная процедура для Fibrosis TNBS будет полезно объяснить клеточные механизмы кишечного фиброза.
Protocol
Для этой рукописи все образцы человека были закуплены в соответствии с утвержденным протоколом Советом по обзору Института (IRB) и Комитетом по исследованиям в области человеческого потенциала в Медицинском колледже Олбани. Все исследования с участием животных строго соблюдались в соответствии с утвержденным протоколом Институционального комитета по уходу за животными и использованию в медицинском колледже Олбани, а также Национальными институтами здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных . 1. Сбор образцов кишечника человека Сбор образцов тканей человека в соответствии с протоколами исследовательского комитета учреждения. Приобретение кишечной ткани (илеоколонической) пациента CD с диагнозом фиброз и контрольные образцы от пациентов, не история IBDs. Используйте часть кишечной ткани для иммуногистологии, другую часть ткани для анализа мРНК, а заключительную часть для белковой экспрессии фиброзных и цитокинских генов/маркеров. Для иммуногистологического анализа сначала зафиксируйте образец тканей человека в 4% параформальдегида в течение по крайней мере 48 ч, а затем переветривайте его в трубку, содержащую 70% этанола, по крайней мере, на 16 ч. Используйте эту фиксированную ткань для создания парафин-встроенного блока и вырежьте 5 мкм толщиной ткани разделов с помощью ткани-микротома. Используя кисть, аккуратно разложите каждый разрез на стеклянную горку для окрашивания. Пятно ткани слайд с трихромным пятном для обнаружения осаждения коллагена, и с пятном SMA для обнаружения миофибробластов (см. раздел 3 для получения подробной информации о трихромных и SMA окрашивания). Изучите окрашенные секции под легким микроскопом. Обработайте другую часть полученного образца тканей человека, чтобы сделать лизат белка для обнаружения ЗСМА с помощью западной подьение (см. раздел 7 для получения подробной информации об анализе западной побелки). Получить РНК из конечной части образца тканей человека с помощью реагента экстракции(Таблица материалов)и преобразовать мРНК в кДНК через RT-PCR. Анализ фиброзных и цитокинных генов по qPCR (см. раздел 6 для получения подробной информации о препарате мРНК). 2. Индукция фиброза TNBS и лечение рапамицина у мышей Проведение исследований на животных в соответствии с протоколами исследований на животных, утвержденными учреждением. Бритье взрослых мышей вокруг области шеи для того, чтобы предварительно сенсибилизировать TNBS через дермальной экспозиции. Замочите TNBS в ватном тампоне, а затем применить TNBS к бритой области шеи мыши.ПРИМЕЧАНИЕ: Предсензитизация является очень важным шагом, поскольку она улучшает задержку реакции гиперчувствительности, чтобы инициировать воспаление, опосредованное TNBS. Восемь дней после предварительной сенсибилизации, вызвать колит внутриректальное введение один раз в неделю в течение шести недель. Нанесите четыре мг TNBS (в 25% этанола) с помощью 100 л клизма через шприц 1 мл прилагается к 3,5 французский полиуретановый катетер и дать контроль мышей 100 л 25% этанола только. Анестезия мышей с пентобарбитал (25 мг/кг интраперитонеальной) или подвергать их 2,5% изофлуран вместе с 1 л / мин кислорода во время введения TNBS. Подтвердите анестезию, мягко щипая утраты ног и глядя на отсутствие рефлекса. Используйте ветеринарную мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость в то время как мыши находятся под наркозом. Вводят рапамицин при 2 мг/кг/день или транспортное средство (5% Tween-20 и 4% этанола) каждый будний день в течение 3-6 недель, интраперитонеальный, как для контроля, так и для обработанных TNBS мышей. Используйте 6-недельный TNBS пост-обработанный кишечник мышей для анализа внеклеточных анализов, включая гистологию, цитометрию потока, западные промотирования и экстракции РНК. Для сбора органов, эвтаназии мышей с помощью CO2 ингаляции и подтвердить эвтаназии с вывихом шейки матки. Для сбора органов, эвтаназии мышей с помощью CO2 ингаляции и подтвердить эвтаназии с вывихом шейки матки. После эвтаназии продольно открываем мышь на брюшной стороне с помощью хирургических ножниц и щипцизнов. Удалите всю толстую кишку из прямой кишки в области подвижаемого терминала. Быстро перенесите толстую кишку в ледяной 1x HBSS и промойте толстую кишку с помощью того же буфера. Измерьте и сравните длину толстой кишки управления и TNBS-обработанных мышей. Сделайте этот шаг как можно быстрее, чтобы избежать высыхания из толстой кишки, чтобы избежать смерти клеток. Разрежьте толстую кишку на мелкие кусочки и держите при -80 градусов по Цельсию для хранения для будущих целей (анализ РНК/западной подрезки). Используйте другой кусок толстой кишки для анализа FACS. Обязательно вырезать и собрать образцы толстой ткани из аналогичных областей толстой кишки как контроль, так и TNBS обработанных животных.ПРИМЕЧАНИЕ: 10%-20% смертности, как ожидается, с прививкой TNBS, хотя с опытом, уровень смертности может быть значительно снижена. 3. Иммуно-гистопатологическая оценка фиброза кишечника Исправить ткани человека и/или мышей в 4% параформальдегида на 48 ч, а затем передать на 70% этанол на 16 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Параформалдегид является нейротоксическим химическим веществом, поэтому избегайте вдыхания; использовать маску для лица при ее использовании. Парафин вставлять фиксированные ткани толстой кишки, нарезать до 5 мкм толщины, и непосредственно положить ткани на стеклянные слайды для гистологии. Выполните H и E и Trichrome Blue окрашивания в соответствии с инструкциями производителя для обнаружения коллагена. Кратко, во-первых deparaffinize разделы путем погружать скольжения содержа разделы в 2 камерах xylene для 5 минут в каждой камере. Промыть слайды со 100% алкоголем на 1 мин; повторить этот шаг три раза. Снова промыть водопроводной водой в течение 1 мин. После этого погрузите слайды в разогретую раствор Bouin при 56 градусах по Цельсию в течение 60 мин. Решение Bouin желтого цвета по внешнему виду; мыть после вынимая слайды из раствора Буин в водопроводной воде в течение 3 минут или до тех пор, пока слайды стали бесцветными. Погружение слайды в модифицированный Mayer в гематаксилина раствор в течение 7 минут при комнатной температуре. Пятно слайды, погружая в трихромное пятно в течение 5-8 мин. Немедленно, промыть слайды в проточной воде для 5-10 с, чтобы удалить избыток трихромного пятна. Обезвождение слайды со 100% алкоголем в течение 1 мин. Повторите эту процедуру три раза. Очистить слайды с ксиленом в течение 1 мин и повторить шаг 3x. Гора слайды с монтажом средствмассовой информации( Таблица материалов ). Тщательно держите coverslip на одном конце с щипками и дайте ему покрыть весь раздел без каких-либо пузырьков. Если есть некоторые пузырьки, быстро удалить пузырьки, нажав на крышку. Используйте иммуностогирование для обнаружения ЗСМА. Блок толстой кишки разделов в блокировании буфера (0,2% Тритон X-100 и 5% нормальной сыворотки козы в 1x PBS) для 1 ч при комнатной температуре. Инкубировать с 100 л разбавленных первичных антител для SMA (Таблица материалов) на слайд-раствор (0,2% Тритон X-100 и 3% нормальной козьей сыворотки в 1x PBS; анти-ЗСМА 1:200) на 4 градуса цельсия в одночасье. Вымойте разделы три раза с 1x PBS. Используйте коза анти-мышь IgG (H и L) сопряжены с Alexa Fluor 488 (Таблица материалов) в качестве вторичного антитела для 2 ч при комнатной температуре. Вымойте разделы три раза с 1x PBS. Используйте DAPI для противопоставления ядра в течение 5 мин. Вымойте разделы три раза с 1x PBS. Монтировать слайды с флуоресцентными монтажными носителями(Таблица материалов),и печать с крышкой с помощью лака для ногтей. Приобретайте изображения с помощью конфокального микроскопа LSM 880 и обрабатываете изображения с помощью программного обеспечения для микроскопов. Количественная оценка изображений, принимая в среднем несколько выбранных областей в одном разделе с ImageJ. 4. Изоляция кишечной ламины propria и очищение Cx3Cr1- моноядерные фагоциты Продольно открыть толстой кишки в ледяной Хэнк сбалансированного соляного раствора (HBSS; Таблица материалов) и мыть толстой кишки с тем же буфером. Вырезать примерно 5 см мелкие кусочки толстой кишки тканей с помощью стерильных ножниц в HBSS. Передача небольших частей ткани толстой кишки в 50 мл конической трубки, содержащей 10 мл предварительного переваривания буфера (1x HBSS с 5% FBS, 5 мМ EDTA и 1 мМ DTT), и встряхнуть в течение 20 минут при 100 об/мин в 37 КС инкубатор11.ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация толстой ткани в 37 градусов по Цельсию при 100 об/мин встряхивания состояние позволяет эффективное переваривание ткани коллагеназа и высокий выход жизнеспособных клеток. Откажитесь от отдельного опигелия толстой кишки, проходя через 40 мкм ячейки ситечко. Соберите оставшуюся ткань из ситечка и далее переварить их в пищеварительном буфере, содержащем Коллагеназа типа IV и DNase I (Таблица материалов) в 1x HBSS с 5% FBS в течение 20 минут при 37 градусах по Цельсию при 100 об/мин. Vortex переваренных тканей примерно 20 с и пройти через 40 мкм клеточной ситечко для получения ламины проприифракции фракций. Центрифуга ламины проприия фракций гранулы вниз клетки на 700 х г в 4 КК Чтобы исключить мертвые клетки из проприии ламина используйте градиент плотности(Таблица материалов).ПРИМЕЧАНИЕ: Градиент плотности, используемый здесь(Таблица материалов),может привести к потере моноядерных клеток; однако, он значительно удаляет мертвые клетки из препарата, что в целом повышает чистоту. Сделайте 100 мл каждый из 30% и 70% плотности градиентных медиа-решений. Отрежь полученные клетки в 10 мл 30% раствора и накладка поверх 5 мл 70% раствора в трубке 15 мл. Центрифуги градиент ажиотаж в состоянии без тормозов при температуре 1000 х и комнатной температуре. Соберите белую фазу кольца, содержащую лиминпромы лимфоцитов, которая будет между 30% и 70% градиентных слоев. Вымойте полученные клетки путем повторного приостановки в ледяной HBSS и центрифуги при 500 х г, 20 кв, в течение 10 мин. Повторно приостановить клетки в FACS (флуоресцентно-активированная сортировка клеток) буфер (PBS, pH 7.4, с 1% BSA и 2 мМ EDTA). Очистка мононуклеарных фагоцитов от собранных клеток очистки с помощью магнитных бусин и / или Сортировки FACS. Магнитная очистка До окрашивания антителами, первый блок клеточной поверхности клеток ламины проприия клеток путем инкубации с анти-мышь CD16/CD32 Fc блокатор в течение 15 минут на льду. Инкубировать клетки с анти-Cx3Cr1-PE (фикеретрин) антитела вместе с анти-PE microbeads (Таблица материалов) в течение 30 минут на льду, чтобы захватить связанных клеток. Вымойте ячейки с буфером FACS. Передайте клетки, связанные с антителами/бисиной, через магнитно-активированную колонку сортировки клеток в магнитном поле для удаления несвязанных клеток. Вымойте три раза с буфером FACS. Снимите столбец с магнитного поля и нажмите поршень в колонке, чтобы дать бисером связанных клеток. Сортировка FACSПРИМЕЧАНИЕ: сортировка FACS может быть использована вместо магнитной очистки. Несмотря на то, что магнитное очищение является простым и экономичным методом, оно ограничивается только очищением одиночных клеток, а не субпопуляциями клеток. Поэтому для изоляции субпопуляций клеток метод сортировки FACS является эффективным методом сортировки одиночных клеток, а также субпопуляций клеток. Блок ламина проприия клетки с анти-мышь CD16/CD32 Fc блокатор (Таблица материалов). Пятно клетки путем инкубации с анти-CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C, и MHCII антител. Сортировать с помощью цитометра потока FACS, gating для CD11c-CD64cd11b и Cx3Cr1и Ly6C- клетки для очистки CX3Cr1 (P3 и P4) населения. Lyse отсортированные клетки для полного подготовки РНК и обнаружения цитокинов и фиброзных маркеров (см. раздел 6 для РНК и кДНК подготовки). Проанализируйте выражение мРНК фиброзных маркеров и воспалительный анализ цитокинов с выделениями одноклеточных суспензий от магнитной очистки. Для анализа FACS, блок-клетки с анти-мышь CD16/CD32 Fc блокатор (Таблица материалов) до окрашивания антителами против поверхности или внутриклеточных маркеров. 5. Анализ цитометрии потока Окрашивание и анализ поверхности клеток Resuspend 5-10 и 10изолированных клеток ламины проприии в 50 мл буфера FACS (1% BSA, 2 мМ EDTA в PBS, рН 7.4). Инкубировать клетки с анти-мышь CD16/CD32 (Таблица материалов) в 1:50 разбавления блокировать fc рецепторов на льду в течение 10 минут. Мыть клетки с 500 л ледяного буфера FACS для удаления несвязанных анти-CD16/CD32 до окрашивания клеточной поверхности. Поверхностные пятна толстой кишки одноклеточных суспензий (106 клеток / 50 мл) с флуоресцентной маркировкой антитела на 1:100 разбавления на льду в течение 30 минут для оценки кишечной ламины проприи. Вымойте помеченные клетки с 500 злителками ледяного буфера FACS дважды, чтобы удалить несвязанные антитела. Анализ помеченных моноядерных клеток с помощью цитометрии потока. Ворота для Live, затем для FSCsSC,а затем CD11bи Cx3Cr1 , а затем проанализировать другие маркеры активации макрофага, включая MHCII, CD80, CD86 и CD40. Внутриклеточные окрашивания цитокинов и анализ Для внутриклеточного окрашивания цитокинов, исправить и permeabilize поверхностных окрашенных клеток с помощью фиксации / Пермябилизации Решение Kit (Таблица материалов); пожалуйста, следуйте инструкциям производителя для подробных шагов. Ворота ламина проприийные клетки для Live, затем для FSCsSC,а затем CD11bи Cx3Cr1-IL23, чтобы обнаружитьвнутриклеточный уровень цитокинов IL23 и CD11b обнаружить внутриклеточный уровень цитокинов IL1. Окрашивание и анализ SMA Вымойте ячейки с faCS буфера дважды центрифугировании на 200 х г и 4 КК в течение 5 минут, чтобы удалить избыток фиксаторного буфера. Для определения уровня ЗСМА, пермяки клетки с фиксацией / Пермябилизация Решение Kit (Таблица материалов). Инкубировать клетки с анти-ЗСМА-AF488 антитела (Таблица материалов) с использованием 1:1,000 разбавления на льду в течение 30 мин. Вымойте клетки дважды, а затем сделать анализ FACS. Ворота для живых, FSCиSSC, а затем обнаружениеклеток в клетках толстой кишки. 6. Изоляция РНК, RT-PCR, ПЦР в реальном времени Изолировать РНК из MACS или FACS очищенных клеток или толстой кишки вырезанной ткани путем гомогенизации их в реагент экстракции (Таблица материалов).ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте защитные очки и другие лабораторные защитные приспособления при работе с этим реагентом, так как это раздражающий вещества для легких и кожи. Работайте безопасно в капюшоне. Добавьте 0,5 л гликогена без РНАЗе из 20 мкг/мл гликогенного раствора(Таблица материалов),чтобы улучшить восстановление общей РНК до осаждения РНК с изопропанолом. Приостановите рнк-гранулы в 50 qL свободной воды RNase(Таблица материалов)и инкубировать при 55 градусах По Цельсия в течение 5 минут, чтобы полностью растворить неба РНК. Прочитайте концентрации РНК с помощью спектрофотометра на уровне 260 нм. Синтезировать кДНК с использованием 1 мкг общей РНК и обратного набора синтеза транскрипции(Таблица материалов). Проанализируйте экспрессию генов, используя 2 ЗЛ кДНК в качестве шаблонов с помощью ПЦР в реальном времени. Используйте 96-колодую пластину PCR qPCR Master Mix комплект(Таблица материалов). Используйте значения КТ для расчета изменения сгиба rnA изобилия после нормализации значений GAPDH/HPRT. 7. Западный промотирование Лисы ткани толстой кишки с помощью буфера лиза RIPA (1% NP40). Разрешить лизат белка в 8% бис-Трис гель при постоянном напряжении 80 В. Передача геля-белка в мембрану нитроцеллюлозы (ы) в буфере холодной передачи, работающую при постоянном токе 50 мА в течение 2 ч при 4 градусах Цельсия. Блок неспецифических регионов на белка переданы мембраны с использованием 5% обезжиренного молока в TBST (25 мм Tris-HCl, рН 7,4, 1,5 М NaCl, 0,05% Tween-20) по крайней мере 1 ч при комнатной температуре. Чтобы обнаружить уровни ЗСМА, инкубировать мембрану (ы) с антителами первичного обнаружения SMA при 4 градусах Цельсия в течение ночи. Вымойте мембраны 3-4 раза с помощью TBST в 15 минут интервалов. Инкубировать с HRP-конъюгированных вторичных антител (1:10,000) в 5% обезжиренного молока в TBST. Разработка мембран с использованием комплекта ECL. Нормализация интенсивности сигнала белка с ПОМОЩЬю GAPDH в качестве контроля нагрузки для анализа денситометрии. 8. Статистический анализ Проанализируйте данные с помощью программного обеспечения для анализа данных, сравнивая дикий тип и KO животных. Рассмотрите значение P-стоимости в размере 0,0,05 евро, чтобы быть значительным (П Злт; 0,05; Злт; 0,01; Используйте T-тест Student для проверки различий между двумя группами и теста ANOVA для анализа между более чем двумя группами.
Representative Results
Мы приняли модель мыши TNBS colitis для изучения и выяснения основных механизмов кишечного фиброза8. Здесь мы провели детальное изучение времени курса TNBS-опосредованного колита, где TNBS был ректально администрируется еженедельно диких мышей типа на срок до шести недель, как представлено схематично (Рисунок 1A). После шести недель лечения TNBS, мы заметили, что длина толстой кишки сокращается постепенно в течение лечения TNBS, от среднего от 5 и 0,5 см в контрольной группе до 3 и 0,5 см в группе TNBS; такой количественный анализ длины толстой кишки представляет собой очень очевидное сокращение длины толстой кишки(рисунок 1B). Чтобы убедиться, что модель болезни TNBS Crohn сравнима с моделью фиброза человека Крона и не была артефактом, связанным с методологией, мы проанализировали фиброзные маркеры на нескольких уровнях в детальном изучении курса времени для инъекции TNBS в дикий тип . Накопление альфа-гладких мышечных актина (ЗСМА) положительных клеток и осаждения коллагена в подмукозных слоях были зарегистрированы в большинстве случаев фиброза и рассматривается как отличительная черта для фиброзных событий14. Мы обнаружили, что секции толстой кишки TNBS обработанных мышей, которые были окрашены с ЗСМА показал 4-6-кратное увеличение в толстой части подмукозы слой положительно окрашенных с ЗСМА (Рисунок 1C). Кроме того, трихромное синее окрашивание для этих секций также показало 2-4-кратное увеличение, что свидетельствует о значительном осаждении коллагена, что подтверждает тяжелый фиброз кишечника(рисунок 1D). Мы также оценили активацию миофибробластов путем обнаружения ЗСМА-положительных клеток с помощью анализа FACS в TNBS-обработанных мышей толстой кишки и обнаружили значительное накопление ЗСМА-положительное окрашивание (Рисунок 1E). Кроме того, мы обнаружили существенную индукцию в выражении ЗСМА, Col-I и Col-III, измеренных анализом qPCR у обработанных ТНБС мышей(рисунок 1F). Повышенная экспрессия белка ЗСМА в западном анализе помок выявила повышенный фиброз(рисунок 1G). В целом, лечение кинетикой TNBS дает возможность получить доступ к условному иммунному ответу при хронических заболеваниях, который тесно имитирует хроническое фазовое состояние CD и имеет важное значение для развития фиброза. Для сравнения фиброза TNBS с связанным с Кроном фиброзом, мы проанализировали выражение фиброза маркеров и цитокинов в биопсии свежих тканей из подылости пациентов с активным CD или под ремиссией. Примечательно, что мы обнаружили отмеченную индукцию утолщения положительных слоев и увеличение осаждения коллагена, обнаруженного треххромным окрашиванием в активных секциях КОМПАКТ(рисунок 2A). Мы также провели западный анализ помарки и подтвердили индукцию экспрессии ЗСМА в активных образцах компакт-дисков(рисунок 2B). Кроме того, мы наблюдали значительную индукцию фиброзмаркеров, включая ЗСМА, Col1, как обнаружено анализом qPCR(рисунок 2C). Далее, чтобы определить механизм ограничения фиброза TNBS мы оценили эффекты рапамицина, фармакологического ингибитора деятельности mTOR15,16. Соответственно, мы лечили мышей как с TNBS и рапамицин и проанализировали уровень SMA и коллагена в гистологии толстой кишки и показали количественное измерение ЗСМА и коллагена в денситометрии участка (Рисунок 3A). Наши данные свидетельствуют о том, что рапамицин уменьшает положительное окрашивание в подмукозном слое и уменьшает осаждение коллагена. Для дальнейшей проверки и количественной оценки фиброзных реакций, мы определили выражения зСМА, коллагена и TGF, qPCR, и экспрессию SMA по цитометрии потока в тНБС-обработанной толстой кишки(Рисунок 3B, 3C). Мы также показали, Cx3Cr1и моноядерные фагоциты вызывают воспалительный иммунный ответ на травму9. Таким образом, мы хотели бы видеть, если администрация рапамицина в TNBS обработанных мышей может обратить вспять воспалительные и фиброзные эффекты. Таким образом, мы очищали Cx3Cr1- резидентов моноядерных фагоцитов от суспензий одноклеточных колотиц с помощью магнитных микробусов(рисунок 3D). Мы обнаружили повышенный уровень p-p70 и p-S6 в Cx3Cr1- резидентных моноядерных фагоцитах по западному анализу помок от обработанных ТНБС мышей, и этот уровень был заблокирован рапамицином(Рисунок 3E). Кроме того, мы обнаружили, что лечение рапамицином ослабляет IL-23 и IL-1 в группе TNBS-обработанных(рисунок 3F). Кроме того, эти выводы разъясняет эффективный механизм, участвующий в индукции TNBS-фиброз и показали, что рапамицин замедляет индукцию фиброза. Рисунок 1: Успешное введение TNBS приводит к развитию кишечного фиброза у мышей. A. Схема тихая диаграмма представление еженедельного лечения TNBS, пристеченного для мышей дикого типа. B. Колон изображения и измерения длины толстой кишки от TNBS обработанных мышей, собранных на недели 0, 2, 4, и 6 после Лечения TNSB. С-Д. Гистологический анализ секций толстой кишки, окрашенный антителами против ЗСМА для активации миофибробластов и трихромного синего окрашивания коллагена; шкала бар 100 мкм. Е. Анализ FACS для выявления зСМА-позитивных клеток в толстой кишке и количественной оценки зСМА-позитивных клеток. F. Фиброзические маркеры и цитокины, обнаруженные qPCR. G. Западный анализ поблужки зСМА из лизата толстой кишки TNBS-обработанных и контрольных мышей. Эта модифицированная цифра используется повторно с разрешения предыдущей публикации9 в Mucosal Immunology, 2019 Mathur et al. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры. Рисунок 2: TNBS Фиброз сравним с Крона связанных кишечного фиброза. A. Репрезентативные изображения биопсии толстой кишки управления, активный CD, показывающий значительное увеличение трихромного синего окрашивания и ЗСМА-положительное окрашивание в подмукозных слоях, шкала бар 50 мкм. B. Западный анализ поблужев выражения и количественной оценки. C. qPCR анализ фиброзных маркеров и цитокинов. Эта модифицированная цифра используется повторно с разрешения предыдущей публикации9 в Mucosal Immunology, 2019 Mathur et al. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры. Рисунок 3: Рапамицин лечение эффективно уравновешляет TNBS-индуцированных фиброз. A. Colon гистологический анализ – репрезентативные изображения миофибробластного окрашивания антителами и коллагеном окрашивания с трихромным синим, шкала бар 100 мкм. B. qPCR анализ “SMA, коллагена и TGF” выражение в управлении / TNBS-обработанных толстой кишки мыши. C. FACS анализ ЗСМА в одноклеточной подвеске из толстой кишки мыши, обработанной control/TNBS. D. Схема для очищения клеток Cx3Cr1- из фракции проприии двоеточия ламины и FACS анализ очищенных клеток. E. Западный анализ помок уровня р-p70 и p-S6 в очищенных моноядерных фагоцитах Cx3Cr1 от мышей, обработанных ТНБС и/или рапамицином. F. qPCR анализ экспрессии в очищенных моноядерных фагоцитах Cx3Cr1, которые производят ИЛ-23 и Ил-1. Эта модифицированная цифра используется повторно с разрешения предыдущей публикации9 в Mucosal Immunology, 2019 Mathur et al. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.
Discussion
Заживление ран или восстановление тканей является жестко регулируемым биологическим процессом17. Во время повреждения тканей с химическим, механическим и инфекционным состоянием, воспалительный ответ запускает процесс восстановления тканей. Однако дисрегулируемая и патологическая воспалительная реакция приводит к развитию рубцов или фиброзной реакции, которая может нарушить функцию восстановления тканей9,18,19. Здесь мы показываем процедуру для модели животного fibrosis, индуцированной TNBS, которая значительно разделяет патофизиологию с болезнью человека Крона. Последовательная прививка химического воздействия TNBS для повреждения эпителия мыши вызывает глубокие язвы и вызывает развитие фиброза. С надежной, низкой стоимости, и быстрой индукции заболевания начала, этот метод широко принят несколькими исследовательскими группами, участвующими в исследованиях для повреждения тканей, трансмурального воспаления и оси кишечника мозга.
Для успешной реализации модели фиброза TNBS существует несколько важных шагов. Например, адекватная дозировка и сроки введения TNBS очень важны. Прививка TNBS 6-8 недель позволяет глубоко йогу ткани и настоятельно рекомендуется для хронических фиброзных исследований. Выход стула от мышей и ретроградный рефлекс привитых TNBS являются двумя основными проблемами, которые могут привести к доставке переменных доз для мышей. Нежное давление вблизи прямой кишки мышей может помочь освободить стул до введения TNBS. Удерживая голову животного вниз в течение нескольких секунд резко помогает остановить обратный рефлюкс TNBS. Держать мышей в клетке, устанавливать клетку на пусковой площадке жары, и обеспечивать мышей с нектаром Napa смогл также быть полезными стратегиями в предотвращать высокую смертность.
Здесь мы также обсуждаем воспаление кишечника во время фиброза TNBS и их влияние на фиброзную реакцию. mTOR / аутофагия роль широко вовлечены на кишечный гомеостаз и в IBD патогенез20,21. Мы определили, что mTOR /аутофагия сигнализации имеет решающее значение для модулировать провоспалительных реакций от IL-23 и IL1 ‘цитокинов от Cx3Cr1– моноядерные фагоциты, которые влияют на про-фиброзной ил-23/IL-22 оси (Рисунок 3A)9 . Таким образом, очистка одного Cx3Cr1– моноядерных клеток для иммунопропорождения и экспрессии генов является критическим шагом модели. Мы подробно обсуждаем протокол для изоляции ламины проприи и предоставляем процедуру очистки моноядерных клеток Cx3Cr1с использованием магнитных бусин.
В совокупности, несмотря на наличие генетических и спонтанных моделей болезни Крона, TNBS-колит остается мощным инструментом для изучения иммунопатогенеза CD и имеет потенциал для оценки лечения фиброза Крона. Основным ограничением использования химически индуцированных моделей фиброза, таких как TNBS, является вероятность высокой изменчивости от пользователя к пользователю и возможность выбросов в данных. Размер выборки 5-8 животных в группе наряду с большим пользовательским опытом может увеличить консистенцию модели. Тем не менее, найти подходящую генетическую модель, вызывающую спонтанный фиброз Крона, это всегда будет оправдано.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана ГРАНТом NIH R01NS093045 (Y.H.), грантом NIH K08DK088950 (X.З.), R03DK099566 (X.З.) и Научно-исследовательским стипендией Фонда Крона и Колита Америки (CCFA) 481637 (R.M.).
Materials
| Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4 | e-bioscience | 53-9760-82 | |
| Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77 | e-bioscience | 149760-80 | |
| Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70 | Biolegend Inc | 101226 | |
| Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11 | Biolegend | 149006 | |
| Anti-mouse purified CD16/32 Fc block | Biolegend Inc | 14-9760-80 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-105-639 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | e-bioscience | 7074 | |
| Bovine Serum Albumin | InvivoGen | tlrl-isdn | |
| Collagenase type IV | Roche | 1088866001 | |
| DAPI | SIGMA | D9542 | |
| DMEM | Corning | 10013-CV | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | D263-5vl | |
| Falcon® 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit | BD Bioscience | 555028 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | www.flowjo.com | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | e-bioscience | 5018 | |
| Graphpad Prism 7 | GraphPad Software Inc | www.graphpad.com | |
| H&E kit | American Mastertech Kit | HXMMHPT | |
| Image J | NIH | www.imagej.nih.gov/ij/ | |
| Mouse: C57BL/6J | Jackson Laboratories | 664 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Percol | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| PMA/Ionomycin salt | Sigma | P8139 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermofisher | A25777 | |
| Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11 | Cell signaling | 5174 | |
| Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7 | Cell signaling | 2708 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371 | Cell signaling | 9208 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E | Cell signaling | 4858 | |
| Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein | Cell signaling | 2217 | |
| Rapamycin | LC LABORATORIES | 1003799 | |
| TNBS | Sigma | 92823 | |
| Trichorme staining kit | American Mastertech Kit | STOSTBPT | |
| TRIzol | Life technologies | 15596018 | |
| Verso cDNA Synthesis Kit | Thermofisher | AB1453B | |
| Zen black 2.1 | Carl Zeiss | www.zeis.com | |
| Zen blue lite 2.3 | Carl Zeiss | www.zeis.com |
References
- Garrett, W. S., Gordon, J. I., Glimcher, L. H. Homeostasis and inflammation in the intestine. Cell. 140, 859-870 (2010).
- Park, S. G., et al. T regulatory cells maintain intestinal homeostasis by suppressing gammadelta T cells. Immunity. 33, 791-803 (2010).
- Speca, S., Giusti, I., Rieder, F., Latella, G. Cellular and molecular mechanisms of intestinal fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18, 3635-3661 (2012).
- Keubler, L. M., Buettner, M., Hager, C., Bleich, A. A Multihit Model: Colitis Lessons from the Interleukin-10-deficient Mouse. Inflammatory Bowel Disease. 21, 1967-1975 (2015).
- Strober, W., Nakamura, K., Kitani, A. The SAMP1/Yit mouse: another step closer to modeling human inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 107, 667-670 (2001).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology-Gastroenterology and Liver Physiology. 296, G135-G146 (2009).
- Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery. 11, 9-15 (2016).
- Loeuillard, E., et al. 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced chronic colitis with fibrosis and modulation of TGF-beta1 signaling. World Journal of Gastroenterology. 20, 18207-18215 (2014).
- Mathur, R., et al. Induction of autophagy in Cx3cr1(+) mononuclear cells limits IL-23/IL-22 axis-mediated intestinal fibrosis. Mucosal Immunology. 12, 612-623 (2019).
- Joeris, T., Muller-Luda, K., Agace, W. W., Mowat, A. M. Diversity and functions of intestinal mononuclear phagocytes. Mucosal Immunology. 10, 845-864 (2017).
- Mathur, R., et al. A mouse model of Salmonella typhi infection. Cell. 151, 590-602 (2012).
- Zhao, X., et al. Noninflammatory Changes of Microglia Are Sufficient to Cause Epilepsy. Cell Reports. 22, 2080-2093 (2018).
- Murugaiyan, G., et al. MicroRNA-21 promotes Th17 differentiation and mediates experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 125, 1069-1080 (2015).
- Hinz, B., Celetta, G., Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Chaponnier, C. Alpha-smooth muscle actin expression upregulates fibroblast contractile activity. Molecular Biology of the Cell. 12, 2730-2741 (2001).
- Yang, J., et al. Rapamycin Inhibition of mTOR Reduces Levels of the Na+/H+ Exchanger 3 in Intestines of Mice and Humans, Leading to Diarrhea. Gastroenterology. 149, 151-162 (2015).
- Mutalib, M., et al. The use of sirolimus (rapamycin) in the management of refractory inflammatory bowel disease in children. Journal of Crohns and Colitis. 8, 1730-1734 (2014).
- Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair at a glance. Journal of Cell Science. 122, 3209-3213 (2009).
- Paul, J., et al. IL-17-driven intestinal fibrosis is inhibited by Itch-mediated ubiquitination of HIC-5. Mucosal Immunology. 11, 427-436 (2018).
- Sohail, I., Ghosh, S., Mukundan, S., Zelewski, S., Khan, M. N. Role of Inflammatory Risk Factors in the Pathogenesis of Streptococcus pneumoniae. Frontiers of Immunology. 9, 2275 (2018).
- Laplante, M., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth control and disease. Cell. 149, 274-293 (2012).
- Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448, 427-434 (2007).
Cite This Article
Mathur, R., Alam, M. M., Zhao, X., Huang, Y., Zhu, X. Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin. J. Vis. Exp. (151), e60067, doi:10.3791/60067 (2019).