Aperçu mécaniste du développement de la fibrose intestinale médiée par tNBS et évaluation des effets inhibiteurs de la rapamycine

Pour ce manuscrit, tous les échantillons humains ont été achetés selon le protocole approuvé par la Commission d’examen de l’Institut (IRB) et par le Comité de recherche humaine du Albany Medical College. Toutes les recherches impliquant des animaux ont été strictement suivies selon le protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Albany Medical College ainsi que le National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals . 1. Collecte de spécimens intestinaux humains Recueillir des échantillons de tissus humains selon les protocoles du comité de recherche de l’institution. Procurer le tissu intestinal (iléocolonique) d’un patient de CD diagnostiqué avec la fibrose et des échantillons de contrôle des patients sans histoire des IBD. Utilisez une partie du tissu intestinal pour l’immunohistologie, une autre partie du tissu pour l’analyse de l’ARNm, et une dernière partie pour l’expression des protéines des gènes/marqueurs fibrotiques et cytokines. Pour l’analyse immunohistologique, fixez d’abord l’échantillon de tissu humain dans 4% de paraformaldéhyde pendant au moins 48 h, puis transférez-le dans un tube contenant 70% d’éthanol pendant au moins 16 h. Utilisez ce tissu fixe pour faire un bloc paraffine ment incorporé et coupez 5 ‘m de tissu épais sections à l’aide d’un microtome tissulaire. À l’aide d’un pinceau, étaler délicatement chaque section coupée sur une lame de verre pour la coloration. La section des tissus de tache glisse avec la tache trichrome pour détecter le dépôt de collagène, et avec la tache de SMA pour détecter des myofibroblastes (voir la section 3 pour l’information détaillée au sujet de trichrome et de coloration de SMA). Examiner les sections tachées au microscope léger. Traiter une autre partie de l’échantillon de tissu humain obtenu pour fabriquer du lysate protéique pour détecter l’AMS par tache occidentale (voir la section 7 pour obtenir des renseignements détaillés sur l’analyse de la tache occidentale). Obtenir l’ARN de la dernière partie de l’échantillon de tissu humain à l’aide d’un réactif d’extraction (Tableau des matériaux) et convertir l’ARNm en aDNc par RT-PCR. Analyser les gènes fibrotiques et cytokine par qPCR (voir la section 6 pour obtenir des renseignements détaillés sur la préparation de l’ARNm). 2. Induction de la fibrose TNBS et du traitement de la rapamycine chez la souris Effectuer des recherches sur les animaux selon les protocoles de recherche sur les animaux approuvés par l’établissement. Raser les souris adultes autour de la région du cou afin de pré-sensibiliser à TNBS par l’intermédiaire de l’exposition cutanée. Tremper le TNBS dans un coton-tige, puis appliquer le TNBS sur la zone rasée du cou de la souris.REMARQUE : La présensibilisation est une étape très importante puisqu’elle améliore la réponse retardée d’hypersensibilité pour initier l’inflammation TNBS-négociée. Huit jours après la présensibilisation, induisez la colite par l’administration intra-rectale une fois par semaine pendant six semaines. Appliquer quatre mg de TNBS (dans 25 % d’éthanol) à l’aide d’un lavement de 100 l à l’aide d’une seringue de 1 ml fixée à un cathéter en polyuréthane de 3,5 Français et donner aux souris témoins 100 l d’éthanol de 25 % seulement. Anesthésiez les souris au pentobarbital (25 mg/kg intrapéritonéal) ou exposez-les à 2,5 % d’isoflurane ainsi qu’à 1 L/min d’oxygène pendant l’administration du TNBS. Confirmer l’anesthésie en pinçant doucement les orteils et en recherchant une absence de réflexe. Utilisez un onduleur vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse pendant que les souris sont sous anesthésie. Injecter de la rapamycine à 2 mg/kg/jour ou véhicule (5 % de Tween-20 et 4 % d’éthanol) tous les jours de la semaine pendant 3 à 6 semaines, intrapéritoneal, à la fois chez les souris témoins et traitées au TNBS. Utilisez l’intestin de souris post-traités de TNBS de 6 semaines pour analyser les essais extracellulaires comprenant l’histologie, la cytométrie de flux, le ballonnement occidental et l’extraction d’ARN. Pour récolter des organes, euthanasier les souris à l’aide de l’inhalation de CO2 et confirmer l’euthanasie par luxation cervicale. Pour récolter des organes, euthanasier les souris à l’aide de l’inhalation de CO2 et confirmer l’euthanasie par luxation cervicale. Après l’euthanasie, longitudinalement ouvrir la souris sur son côté ventral en utilisant des ciseaux de qualité chirurgicale et des forceps. Retirez le côlon entier du rectum à la zone terminale d’ilium. Transférer rapidement le côlon à froid 1x HBSS et laver le côlon à l’aide du même tampon. Mesurer et comparer les longueurs du côlon des souris témoins et traitées au TNBS. Faites cette étape aussi vite que possible pour éviter de sécher les colons afin d’éviter les décès cellulaires. Couper le côlon en petits morceaux et le conserver à -80 oC pour le stockage à des fins futures (analyse de l’ARN/tache occidentale). Utilisez un autre morceau du côlon pour l’analyse FACS. Assurez-vous de couper et de recueillir des échantillons de tissus coloniaux provenant de régions similaires du côlon des animaux témoins et traités par le TNBS.REMARQUE : On s’attend à une mortalité de 10 % à 20 % avec l’inoculation du TNBS, bien qu’avec l’expérience, le taux de mortalité puisse être considérablement réduit. 3. Évaluation immuno-histopathologique de la fibrose intestinale Fixez les tissus humains et/ou souris dans 4 % de paraformaldéhyde pendant 48 h, puis transférez-les à 70 % d’éthanol pendant 16 h.REMARQUE : Le paraformaldéhyde est un produit chimique neurotoxique afin d’éviter l’inhalation; utiliser un masque facial pendant qu’il l’utilise. La paraffine intègre les tissus fixes du côlon, tranche à une épaisseur de 5 m, et met directement les tissus sur des lames de verre pour l’histologie. Effectuez des taches h et E et Trichrome Blue selon les instructions du fabricant pour détecter le collagène. En bref, d’abord déparaffiniser les sections en submergeant la diapositive contenant des sections dans deux chambres de xylène pendant 5 min dans chaque chambre. Rincer les lames avec 100% d’alcool pendant 1 min; répéter cette étape trois fois. Rincer à nouveau avec l’eau du robinet pendant 1 min. Par la suite, plongez les diapositives dans la solution préchauffée de Bouin à 56 oC pendant 60 min. La solution de Bouin est jaune en apparence; laver après avoir sorti les diapositives de la solution de Bouin dans l’eau du robinet pendant 3 min ou jusqu’à ce que les diapositives deviennent incolores. Immerger les toboggans dans la solution d’hématoxylin de Mayer modifié pendant 7 min à température ambiante. Glissez les lames en plongeant dans la tache Trichrome pendant 5-8 min. Immédiatement, rincer les glissières dans l’eau courante pendant 5-10 s pour enlever la tache trichrome excédentaire. Déshydrater les glissières avec 100% d’alcool pendant 1 min. Répétez cette procédure trois fois. Nettoyez les diapositives avec du xylène pendant 1 min et répétez l’étape 3x. Monts toboggans avec supports de montage (Tableau des matériaux). Maintenez soigneusement la feuille de couverture à une extrémité avec des forceps et laissez-la couvrir toute la section sans avoir de bulles. S’il y a quelques bulles, enlevez rapidement les bulles en tapant sur le bordereau. Utilisez l’immunostaining pour détecter l’AMS. Bloquer les sections du côlon en bloquant le tampon (0,2 % Triton X-100 et 5 % de sérum de chèvre normal en 1x PBS) pendant 1 h à température ambiante. Incuber avec 100 l d’anticorps primaires dilués pour la SMA(Tableau des Matériaux)sur la solution de lame (0,2% Triton X-100 et 3% sérum de chèvre normal en 1x PBS; anti-SMA 1:200) à 4 oC pendant la nuit. Laver les sections trois fois avec 1x PBS. Utilisez la chèvre anti-souris IgG (H et L) conjuguée à Alexa Fluor 488 (Table of Materials) comme anticorps secondaire pendant 2 h à température ambiante. Laver les sections trois fois avec 1x PBS. Utilisez DAPI pour contrer le noyau pendant 5 min. Laver les sections trois fois avec 1x PBS. Montez les glissières avec le support fluorescent de montage (Table des matériaux),et scellez avec un coverslip utilisant le vernis à ongles. Acquérir des images à l’aide du microscope confocal LSM 880 et traiter des images à l’aide d’un logiciel de microscope. Quantifiez les images en prenant en moyenne plusieurs zones sélectionnées dans la même section avec ImageJ. 4. Isolement de la lame intestinale propria et purification de Cx3Cr1- phagocytes mononucléaires Ouvrir longitudinalement le côlon dans la solution de sel équilibré de Hank glacée (HBSS; Tableau des matériaux) et laver le côlon avec le même tampon. Couper environ 5 cm de petits morceaux de tissus du côlon à l’aide de ciseaux stériles dans HBSS. Transférer de petits morceaux de tissu du côlon dans un tube conique de 50 ml contenant 10 ml de tampon pré-digestion (1x HBSS avec 5 % de FBS, 5 mM EDTA et 1 mM DTT), et secouer pendant 20 min à 100 tr/min dans un incubateur de 37 oC11.REMARQUE : L’incubation du tissu colonique dans 37 oC à 100 tr/min permet une digestion efficace des tissus de collagène et un rendement élevé de cellules viables. Jetez l’épithélium du côlon détaché en passant par une passoire cellulaire de 40 m. Recueillir le tissu restant de la passoire et les digérer davantage dans un tampon de digestion contenant du collagène de type IV et d’une DNase I(tableau des matériaux)en 1x HBSS avec 5 % de FBS pendant 20 min à 37 oC à 100 tr/min. Vortex les tissus digérés pendant environ 20 s et passer à travers une passoire à cellules de 40 m pour obtenir des fractions de lamina propria. Centrifugeles les fractions de lalaïquepropria pour granuléles vers le bas les cellules à 700 x g dans 4 oC Pour exclure les cellules mortes de la lamina propria utiliser un gradient de densité (Tableau des matériaux).REMARQUE : Le support de gradient de densité utilisé ici (tableau des matériaux) peut causer la perte des cellules mononucléaires ; cependant, il enlève considérablement les cellules mortes de la préparation, ce qui augmente globalement la pureté. Faites 100 mL chacune de 30% et 70% de densité de solutions multimédiagradient. Resuspendre les cellules obtenues dans 10 ml de la solution de 30% et superposer sur 5 ml de la solution de 70% dans un tube de 15 ml. Centrifuger le gradient dans un état sans frein à 1 000 x g et température ambiante. Recueillir la phase d’anneau blanc contenant des lymphocytes lamina propria, qui sera entre les 30% et 70% couches de gradient. Laver les cellules obtenues en se rependant dans le HBSS et la centrifugeuse à 500 x g, 20 oC, pendant 10 min. Re-suspendre les cellules dans le tampon FACS (tri des cellules activées par fluorescence) (PBS, pH 7,4, avec 1% BSA et 2 mM EDTA). Purifie les phagocytes mononucléaires de la purification des cellules collectées à l’aide de perles magnétiques et/ou de tri FACS. Purification magnétique Avant de tacher avec des anticorps, premier bloc de la surface cellulaire des cellules lamina propria en coucuba avec anti-souris CD16/CD32 Fc bloqueur pendant 15 min sur la glace. Incuber les cellules avec des anticorps anti-Cx3Cr1-PE (phycoerythrin) ainsi que des microbilles anti-PE (Table of Materials) pendant 30 min sur glace, pour capturer les cellules liées. Laver les cellules avec le tampon FACS. Passer les cellules liées par l’anticorps/perles à travers une colonne de tri cellulaire activée par magnétique dans un champ magnétique pour enlever les cellules non liées. Laver trois fois avec le tampon FACS. Retirez la colonne du champ magnétique et poussez le piston dans la colonne pour produire des cellules liées aux perles. Tri FACSREMARQUE : Le tri FACS peut être utilisé au lieu de la purification magnétique. Même si la purification magnétique est une méthode facile et rentable, elle se limite à ne purifier que les cellules individuelles, et non pour les sous-populations de cellules. Par conséquent, pour isoler les sous-populations de cellules, la méthode de tri FACS est une méthode efficace de tri des cellules individuelles ainsi que des sous-populations de cellules. Bloquer les cellules lamina propria avec anti-souris CD16/CD32 Fc blocker (Table of Materials). Cellules de tache en couvant avec des anticorps anti-CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C, et mhCII. Trier à l’aide d’un cytomètre de débit FACS, gating pour CD11c-CD64- CD11b- Cx3Cr1- Ly6C- cellules pour purifier la population CX3Cr1 (P3 – P4). Lyse tria les cellules pour la préparation totale de l’ARN et détectez les marqueurs cytokine et fibrotique (voir la section 6 pour la préparation de l’ARN et de l’ADNc). Analyser l’expression de l’ARNm des marqueurs fibrotiques et l’analyse inflammatoire de cytokine des suspensions unicellulaires isolées de la purification magnétique. Pour l’analyse FACS, bloquer les cellules avec anti-souris CD16/CD32 Fc bloqueur (Tableau des matériaux) avant de tacher avec des anticorps contre la surface ou les marqueurs intracellulaires. 5. Analyse de cytométrie de flux Coloration et analyse de la surface cellulaire Resuspendre 5-10 à 105 cellules lamina propria isolées dans 50 mL de tampon FACS (1 % de BSA, 2 mM EDTA en PBS, pH 7,4). Incuber les cellules avec anti-souris CD16/CD32 (Table of Materials) à une dilution de 1:50 pour bloquer les récepteurs Fc sur la glace pendant 10 min. Laver les cellules avec un tampon FACS de 500 l l à froid pour enlever les anti-CD16/CD32 non liés avant la coloration de la surface cellulaire. Suspensions unicellulaires du côlon de surface (106 cellules/50 ml) avec anticorps fluorescents à 1:100 dilution sur glace pendant 30 min pour évaluer la lamina propria du côlon. Laver les cellules étiquetées à l’abri de 500 lde de tampon FACS glacé deux fois pour éliminer les anticorps non liés. Analyser les cellules mononucléaires étiquetées par cytométrie de flux. Porte pour Live, puis pour FSCetSSC, suivi sa CD11bet Cx3Cr1, puis analyser d’autres marqueurs d’activation des macrophages, y compris MHCII, CD80, CD86 et CD40. Coloration et analyse de cytokine intracellulaire Pour la coloration intracellulaire de cytokine, fixer et perméabiliser les cellules de surface-tachées utilisant un kit de solution de fixation/perméabilisation (tableau des matériaux); s’il vous plaît suivre les instructions du fabricant pour des étapes détaillées. Gate lamina propria cellules pour Live, puis pour FSC-SSC- suivie par CD11b- Cx3Cr1-IL23- pour détecter le niveau intracellulaire de cytokine IL23 et CD11b- Cx3Cr1-IL1 détecter le niveau intracellulaire de cytokine IL1MD. Coloration et analyse de la SMA Laver les cellules avec un tampon FACS deux fois en centrifuge à 200 x g et 4 oC pendant 5 min pour enlever l’excès de tampon fixatif. Pour déterminer le niveau de l’AMA, perméabilize des cellules avec un kit de solution de fixation/perméabilisation (Tableau des matériaux). Incuber les cellules avec un anticorps anti-SMA-AF488(Tableau des matériaux)en utilisant 1:1,000 dilution sur la glace pendant 30 min. Lavez les cellules deux fois, puis faites l’analyse FACS. Porte pour la vie, FSCetSSC, suivi de la détection descellules de l’AMA dans les cellules du côlon. 6. Isolation d’ARN, RT-PCR, PCR en temps réel Isoler l’ARN des cellules purifiées MACS ou FACS ou des tissus excisés du côlon en les homogénéisant dans le réactif d’extraction (Tableau des matériaux).REMARQUE : Utilisez des lunettes de sécurité et d’autres équipements de protection de laboratoire lorsque vous travaillez avec ce réactif, car il s’agit d’un irritant pour les poumons et la peau. Travaillez en toute sécurité dans une hotte. Ajouter 0,5 l de glycogène sans RNase à partir de la solution de stock de glycogène de 20 g/mL (Tableau des matériaux) afin d’améliorer la récupération de l’ARN total avant de précipiter l’ARN avec l’isopropanol. Resuspendre la pastille d’ARN dans 50 oL d’eau libre de RNase(Tableau des matériaux)et incuber à 55 oC pendant 5 min pour dissoudre complètement le palais de l’ARN. Lisez les concentrations d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre à 260 nm. Synthétiser l’ADNc à l’aide d’un ARN total de 1 g et d’un kit de synthèse de transcription inversée (Tableau des matériaux). Analyser l’expression des gènes à l’aide de 2 L d’ADNc comme modèles via PCR en temps réel. Utilisez un kit de 96-bien PCR plaque qPCR Master Mix (Table of Materials). Utilisez les valeurs CT pour calculer le changement de pli de l’abondance de l’ARN après la normalisation des valeurs GAPDH/HPRT. 7. Le ballonnement occidental Lyse tissu du côlon en utilisant RIPA tampon de lyse (1% NP40). Résoudre le lysate protéique dans un gel bis-Tris de 8 % à une tension constante de 80 V. Transférer le gel-protéine dans la membrane de nitrocellulose dans un tampon de transfert à froid fonctionnant à un courant constant de 50 mA pendant 2 h à 4 oC. Bloquer les régions non spécifiques sur la membrane transtitique transférée en utilisant 5 % de lait non gras dans le TBST (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1,5 M NaCl, 0,05 % Tween-20) pendant au moins 1 h à température ambiante. Pour détecter les niveaux de l’AMS, incuber la membrane avec l’anticorps de détection primaire de la SMA à 4 oC pendant la nuit. Laver les membranes 3-4 fois à l’aide de TBST en intervalles de 15 min. Incuber avec un anticorps secondaire conjugué par HRP (1:10,000) dans 5 % de lait non gras dans le TBST. Développer des membranes à l’aide d’un kit de développement ECL. Normaliser les intensités de signal protéique avec GAPDH comme un contrôle de chargement pour l’analyse de la densitométrie. 8. Analyse statistique Analyser les données à l’aide d’un logiciel d’analyse de données de choix en comparant entre le type sauvage et les animaux KO. Considérez la valeur P de l’identifique de 0,05 à l’importance (P ‘lt; 0.05; ‘P ‘lt; ‘P ‘lt; ‘P ‘lt; 0.001). Utilisez le test t de l’étudiant pour tester les différences entre deux groupes et le test ANOVA pour l’analyse entre plus de deux groupes.