البصيرة الميكانيكية في تطوير التليف المعوي عبر TNBS بوساطة وتقييم الآثار المثبطة للراباميسين
1Department of Molecular and Cellular Physiology,Albany Medical College, 2The IBD Center, Division of Gastroenterology, Department of Medicine,Albany Medical College, 3Department of Geriatrics, School of Medicine and Health Science,University of North Dakota, 4Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics,Albany Medical College
Summary
في هذه الدراسة، ونحن نصف إجراء مفصل من التليف المعوي TNBS بوساطة، والذي يعرض الفيزيولوجيا المرضية مماثلة للتليف كرون. ونحن نناقش أيضا هذا النهج في ضوء رابامايسين تسهيل الآثار المثبطة على التليف المعوي.
Abstract
وقد أجريت دراسات هامة لفهم الإدارة الفعالة للتليف المعوي. ومع ذلك ، فإن عدم وجود معرفة أفضل بالتليف أعاق تطوير دواء وقائي. في المقام الأول، وإيجاد نموذج حيواني مناسب يشكل تحديا في فهم آلية علم التليف المعوي المرتبط بكرون. هنا، اعتمدنا طريقة فعالة حيث التعرض الكيميائي TNBS لالمستقيم الفئران تنتج تقرح عميق إلى حد كبير والتهاب مزمن، والفئران ثم تطوير التليف المعوي بشكل مزمن. أيضا، ونحن نصف تقنية حيث حقن رابامايسين يظهر آثار مثبطة على التليف TNBS بوساطة في نموذج الماوس. لتقييم الآلية الكامنة وراء التليف، ونحن نناقش بشكل منهجي إجراء لتنقية الخلايا Cx3Cr1 + من بروبريا لامينا من TNBS المعالجة والسيطرة على الفئران. هذا البروتوكول المفصل سيكون مفيدا للباحثين الذين يحققون في آلية التليف وتمهيد الطريق للعثور على اختراع علاجي أفضل للتليف المعوي المرتبط ة كرون.
Introduction
خلل تنظيم التوازن المناعي في الأمعاء يؤدي إلى التهاب المسبب للأمراض وكان معروفا على نطاق واسع أن يسبب مرض التهاب الأمعاء (IBD)1،2. التليف المعوي هو نتيجة مزمنة لأمراض الأمعاء الالتهابية (IBDs)، مثل مرض كرون (CD)3. الفيزيولوجيا المرضية التي لا رجعة فيها من CD تشمل التضيق المعوي أو تضيق التليف، مما يحد من خيارات العلاج، ومع عدم وجود الأدوية المتاحة حاليا، والعلاج الوحيد هو الجراحة. في نهاية المطاف، هناك حاجة ماسة لتطوير العلاجات الفعالة لمواجهة التهاب غير لائق لدراسة آلية مؤتمر نزع السلاح، وهذا سوف يؤدي بنا خطوة أقرب إلى ذلك.
مجموعة متنوعة من نماذج الماوس الوراثية متاحة لدراسة IBD بما في ذلك IL10 KO، SAMP / Yit والتبني CD45+RB نقل الخلايا العالية إلى الفئران SCID4،5،6. هنا، نعرض الإجراء للتليف TNBS بوساطة في نموذج الماوس من CD، والتي هي مماثلة لعلم الأمراض من التليف كرون الإنسان. النموذج الذي يسببه TNBS له مزايا معينة. هذا النموذج بسيط من الناحية الفنية; بداية المرض سريعة وغير مكلفة، ويمكن استخدامها على نطاق واسع في الحيوانات المختلفة (على سبيل المثال، الماوس والفئران وخنزير غينيا7). الإدارة المشتركة للإيثانول وTNBS (2,4,6-trinitrobenzene حامض السلفونيك) يضر فجأة الحاجز المعوي ويعرض بروتين أنسجة القولون إلى TNBS والحصول على استجابات مناعية كبيرة8,9. التعرض المتكرر لTNBS يؤدي إلى عملية إصلاح رد الفعل المفرط الاستجابة للالتهاب والإصابة، ويتطور رد فعل ليفي في الأمعاء. وهكذا، فإن نموذج التليف الناجم عن TNBS يخدم ليكون نموذجا مقنعا جدا لدراسة التليف المعوي المرتبط ة كرون.
وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا الفيغية أحادية النووية هي الخلايا الأولية التي تقوم بالتحكيم في الاستجابة المناعية الفطرية للأمراض والإصابة في الأمعاء10،11،12،13. لتوضيح الآلية الخلوية وتأسيس دور Cx3Cr1+ الخلايا الفيغية أحادية النووية في نموذج التليف TNBS، ونحن نظهر إجراء تنقية الخلايا الهجائية أحادية النووية. تحليل Cx3Cr1+ الخلايا هو خطوة أساسية من أجل تقييم علامات الالتهاب وتحديد الآلية المصاحبة للتليف المعوي. بشكل جماعي، هذا الإجراء المفصل للتليف TNBS سوف تكون مفيدة لشرح الآليات الخلوية للتليف المعوي.
Protocol
وبالنسبة لهذه المخطوطة، تم شراء جميع العينات البشرية وفقا للبروتوكول المعتمد من قبل مجلس مراجعة المعهد (IRB) ولجنة البحوث البشرية في كلية ألباني الطبية. تم اتباع جميع البحوث المتعلقة بالحيوانات بدقة وفقا للبروتوكول المعتمد من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في كلية ألباني الطبية وكذلك المعاهد الوطنية للدليل الصحي لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية . 1. جمع العينات المعوية البشرية جمع عينات الأنسجة البشرية وفقا لبروتوكولات لجنة البحوث في المؤسسة. شراء الأنسجة المعوية (القولون الليو) من مريض CD تشخيص التليف وعينات السيطرة من المرضى الذين ليس لها تاريخ من الـ IBDs. استخدام جزء من الأنسجة المعوية لعلم المناعة، وجزء آخر من الأنسجة لتحليل الحمض النووي الريبي، وجزء نهائي للتعبير عن البروتين من الجينات الليفية والسيتوكين / علامات. لتحليل المناعة، أولا إصلاح عينة الأنسجة البشرية في 4٪ بارافورمالدهايد لمدة 48 ساعة على الأقل ومن ثم نقله إلى أنبوب يحتوي على 70٪ الإيثانول لمدة لا تقل عن 16 ح. استخدام هذه الأنسجة الثابتة لصنع كتلة جزءا لا يتجزأ من البارافين وقطع 5 ميكرومتر الأنسجة السميكة أقسام باستخدام ميكروتومي الأنسجة. باستخدام فرشاة، انتشرت بلطف كل قسم قطع على شريحة زجاجية للتلطيخ. شريحة قسم الأنسجة وصمة عار مع وصمة عار ثلاثي الألوان للكشف عن ترسب الكولاجين، ومع وصمة عار αSMA للكشف عن myofibroblasts (انظر القسم 3 للحصول على معلومات مفصلة حول التصبغ ثلاثي الألوان وαSMA). فحص المقاطع الملونة تحت المجهر الخفيف. معالجة جزء آخر من عينة الأنسجة البشرية التي تم الحصول عليها لجعل lysate البروتين للكشف عن αSMA عبر وصمة عار الغربية (انظر القسم 7 للحصول على معلومات مفصلة حول تحليل اللطخة الغربية). الحصول على الحمض النووي الريبي من الجزء الأخير من عينة الأنسجة البشرية باستخدام كاشف استخراج(جدول المواد)وتحويل الحمض النووي الريبي إلى cDNA عن طريق RT-PCR. تحليل الجينات الليفية والسيتوكين بواسطة qPCR (انظر القسم 6 للحصول على معلومات مفصلة حول إعداد الحمض النووي الريبي). 2. تحريض التليف TNBS وعلاج راباميسين في الفئران إجراء البحوث الحيوانية وفقا لبروتوكولات البحوث الحيوانية التي وافقت عليها المؤسسة. انزعج الفئران البالغة حول منطقة الرقبة من أجل التوعية المسبقة بـ TNBS عن طريق التعرض الجلدي. نقع TNBS في مسحة القطن ومن ثم تطبيق TNBS على منطقة حلق من الرقبة الماوس.ملاحظة: ما قبل التوعية هو خطوة هامة جدا لأنه يحسن استجابة فرط الحساسية تأخر لبدء التهاب TNBS بوساطة. ثمانية أيام بعد التوعية المسبقة، والحث على التهاب القولون عن طريق الإدارة داخل المستقيم مرة واحدة في الأسبوع لمدة ستة أسابيع. تطبيق أربعة ملغ من TNBS (في الإيثانول 25٪) باستخدام حقنة شرجية 100 ميكرولتر عن طريق حقنة 1 مل تعلق على قسطرة البولي يوريثين الفرنسية 3.5 وإعطاء الفئران التحكم 100 درجة مئوية من الإيثانول 25٪ فقط. التخدير الفئران مع البنتوباربيتال (25 ملغ / كغ داخل الشبكية) أو تعريضها إلى 2.5٪ isoflurane جنبا إلى جنب مع 1 لتر / دقيقة من الأكسجين أثناء إدارة TNBS. تأكيد التخدير عن طريق الضغط بلطف أصابع القدم وتبحث عن غياب رد الفعل. استخدام مرهم البيطرية على العينين لمنع الجفاف في حين أن الفئران تحت التخدير. حقن راباميسين في 2 مغ/كغ/يوم أو مركبة (5% توين-20 و 4% إيثانول) كل يوم من أيام الأسبوع لمدة 3-6 أسابيع, داخل الحالبة, لكل من السيطرة والفئران المعالجة TNBS. استخدام 6 أسابيع TNBS بعد علاج الأمعاء الفئران لتحليل الاختبارات خارج الخلية بما في ذلك علم الأنسجة، وتدفق قياس الخلايا، النشاف الغربية واستخراج الحمض النووي الريبي. لحصاد الأعضاء، قتل الفئران باستخداماستنشاق ثاني أكسيد الكربون وتأكيد القتل الرحيم مع خلع عنق الرحم. لحصاد الأعضاء، قتل الفئران باستخداماستنشاق ثاني أكسيد الكربون وتأكيد القتل الرحيم مع خلع عنق الرحم. بعد القتل الرحيم، فتح الماوس طوليا على الجانب البطني باستخدام مقص الصف الجراحية وملقط. إزالة القولون بأكمله من المستقيم إلى منطقة الأيليوم الطرفي. نقل القولون بسرعة إلى الجليد الباردة 1X HBSS وغسل القولون باستخدام نفس المخزن المؤقت. قياس ومقارنة أطوال القولون من عنصر التحكم والفئران المعالجة TNBS. القيام بهذه الخطوة في أسرع وقت ممكن لتجنب تجفيف من القولون من أجل تجنب وفيات الخلايا. قطع القولون إلى قطع صغيرة والحفاظ على -80 درجة مئوية للتخزين لأغراض مستقبلية (تحليل RNA / وصمة عار الغربية). استخدام قطعة أخرى من القولون لتحليل FACS. تأكد من قطع وجمع عينات الأنسجة القولونية من مناطق مماثلة من القولون من كل من السيطرة والحيوانات المعالجة TNBS.ملاحظة: من المتوقع حدوث معدل وفيات بنسبة تفي بين 10% و20% مع التطعيم بين الـ TNBS على الرغم من أنه يمكن خفض معدل الوفيات بشكل كبير مع الخبرة. 3. التقييم المناعي للاعتلال الهيسيالمنتي للتليف الهضمي إصلاح أنسجة الإنسان و / أو الفئران في 4٪ بارافورمالدهايد لمدة 48 ساعة، ومن ثم نقل إلى 70٪ الإيثانول لمدة 16 ساعة.ملاحظة: البارافورمالهايد هو مادة كيميائية سامة للأعصاب لذلك تجنب استنشاق. استخدام قناع الوجه أثناء استخدامه. البارافين تضمين أنسجة القولون الثابتة، شريحة إلى سمك 5 ميكرومتر، ووضع مباشرة الأنسجة على الشرائح الزجاجية لعلم الأنسجة. أداء H & E وTrichrome الأزرق تلطيخ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للكشف عن الكولاجين. باختصار، أولا deparaffinize أقسام عن طريق غمر الشريحة التي تحتوي على أقسام في غرفتين من الزيلين لمدة 5 دقائق في كل غرفة. شطف الشرائح مع الكحول 100٪ لمدة 1 دقيقة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات. شطف مرة أخرى مع مياه الصنبور لمدة 1 دقيقة. بعد ذلك، تزج الشرائح في حل بوين ساخنة مسبقا في 56 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. غسل بعد إخراج الشرائح من حل بوين في مياه الصنبور لمدة 3 دقائق أو حتى أصبحت الشرائح عديم اللون. اغمر الشرائح في محلول هيماتوإكسلين المعدل من Mayer لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الشرائح وصمة عار عن طريق غمر في وصمة عار ثلاثي الألوان لمدة 5-8 دقائق على الفور، شطف الشرائح في المياه الجارية لمدة 5-10 ق لإزالة وصمة عار ثلاثي الألوان الزائدة. تجفيف الشرائح مع الكحول 100٪ لمدة 1 دقيقة. امسح الشرائح مع الزيلين لمدة دقيقة واحدة وكرر الخطوة 3x. تحميل الشرائح مع الوسائطالمتصاعدة (جدول المواد). عقد بعناية غطاء في نهاية واحدة مع ملقط والسماح لها تغطية القسم بأكمله دون وجود أي فقاعات. إذا كان هناك بعض الفقاعات، بسرعة إزالة فقاعات عن طريق النقر على غطاء. استخدام التلطيخ المناعي للكشف عن αSMA. كتلة أقسام القولون في حظر العازلة (0.2٪ تريتون X-100 و 5٪ مصل الماعز العادي في 1X PBS) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. حضانة مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة لαSMA(جدول المواد)على حل الشريحة (0.2٪ تريتون X-100 و 3٪ مصل الماعز العادي في 1X PBS؛ المضادة لαSMA 1:200) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. غسل الأقسام ثلاث مرات مع 1X PBS. استخدام الماعز المضادة للماوس IgG (H + L) مترافقة مع اليكسا فلور 488(جدول المواد)كجسم مضاد ثانوي لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل الأقسام ثلاث مرات مع 1X PBS. استخدام DAPI لمكافحة وصمة عار النواة لمدة 5 دقائق. غسل الأقسام ثلاث مرات مع 1X PBS. جبل الشرائح مع الوسائط تصاعد الفلورسنت(جدول المواد)،وختم مع غطاء باستخدام طلاء الأظافر. الحصول على الصور باستخدام LSM 880 المجهر البؤري ومعالجة الصور باستخدام برنامج المجهر. قم بالتحديد الكمي للصور عن طريق أخذ متوسط مناطق محددة متعددة في نفس القسم باستخدام ImageJ. 4. عزل اللامينا المعوية وتنقية Cx3Cr1+ phagocytes أحادية النووية فتح القولون طوليا في الجليد الباردة هانك محلول الملح المتوازن (HBSS; جدول المواد) وغسل القولون مع نفس المخزن المؤقت. قطع ما يقرب من 5 سم قطع صغيرة من أنسجة القولون باستخدام مقص معقمة في HBSS. نقل قطع أنسجة القولون الصغيرة في أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 10 مل من العازلة قبل الهضم (1X HBSS مع 5٪ FBS، 5 MM EDTA و 1 MM DTT)، ويهز لمدة 20 دقيقة في 100 دورة في الدقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية11.ملاحظة: حضانة الأنسجة القولونية في 37 درجة مئوية في حالة اهتزاز 100 دورة في الدقيقة يسمح لهضم الأنسجة الكولاجين فعالة وارتفاع العائد من الخلايا القابلة للحياة. تجاهل ظهارة القولون منفصلة عن طريق المرور من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر. جمع الأنسجة المتبقية من مصفاة وهضمها أكثر في المخزن المؤقت الهضم التي تحتوي على الكولاجين النوع الرابع وDNase الأول(جدول المواد)في 1X HBSS مع 5٪ FBS لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية في 100 دورة في الدقيقة. دوامة الأنسجة المهضومة لما يقرب من 20 ثانية وتمر من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر للحصول على كسور بروبريا لامينا. طرد مركزي الكسور بروبريا لامينا إلى بيليه أسفل الخلايا في 700 × ز في 4 درجة مئوية لاستبعاد الخلايا الميتة من بروبريا لامينا استخدام تدرج الكثافة(جدول المواد).ملاحظة: قد تتسبب وسائط تدرج الكثافة المستخدمة هنا(جدول المواد)في فقدان الخلايا أحادية النووية؛ ومع ذلك، فإنه يزيل إلى حد كبير الخلايا الميتة من إعداد، مما يزيد عموما من النقاء. جعل 100 مل كل من 30٪ و 70٪ من الحلول وسائل الإعلام التدرج الكثافة. إعادة تعليق الخلايا التي تم الحصول عليها في 10 مل من الحل 30٪ وتراكب على رأس 5 مل من الحل 70٪ في أنبوب 15 مل. الطرد المركزي التدرج في حالة خالية من الفرامل في 1000 × ز ودرجة حرارة الغرفة. جمع مرحلة حلقة بيضاء تحتوي على الخلايا الليمفاوية لامينا بروبريا، والتي سوف تكون بين 30٪ و 70٪ طبقات التدرج. غسل الخلايا التي تم الحصول عليها عن طريق إعادة تعليق في HBSS الجليد الباردة والطرد المركزي في 500 × ز،20 درجة مئوية، لمدة 10 دقيقة. تنقية الفيغسيتات أحادية النووية من تنقية الخلايا التي تم جمعها باستخدام الخرز المغناطيسي و / أو FACS الفرز. تنقية مغناطيسية قبل تلطيخ مع الأجسام المضادة، أول كتلة سطح الخلية من خلايا بروبريا لامينا عن طريق احتضان مع المضادة للماوس CD16/CD32 Fc مانع لمدة 15 دقيقة على الجليد. حضانة الخلايا مع المضادة للCx3Cr1-PE (phycoerythrin) الأجسام المضادة جنبا إلى جنب مع microbeads المضادة للPE(جدول المواد)لمدة 30 دقيقة على الجليد، لالتقاط الخلايا ملزمة. غسل الخلايا مع المخزن المؤقت FACS. تمرير الخلايا المنضمة الأجسام المضادة / حبة من خلال عمود فرز الخلايا تنشيط مغناطيسي في حقل مغناطيسي لإزالة الخلايا غير المنضمة. اغسل ثلاث مرات مع المخزن المؤقت FACS. إزالة العمود من المجال المغناطيسي ودفع الغطاس في العمود لإنتاج خلايا ملزمة حبة. فرز القوات المسلحة الكونغوليةملاحظة: يمكن استخدام فرز FACS بدلا من تنقية المغناطيسي. على الرغم من أن التنقية المغناطيسية هي طريقة سهلة وفعالة من حيث التكلفة، إلا أنها تقتصر على تنقية الخلايا المفردة فقط، وليس على التجمعات السكانية الفرعية للخلايا. لذلك، لعزل التجمعات الفرعية للخلايا، أسلوب الفرز FACS أسلوب فعال لفرز الخلايا المفردة بالإضافة إلى التجمعات الفرعية للخلايا. كتلة خلايا بروبريا لامينا مع مكافحة الماوس CD16/CD32 Fc مانع(جدول المواد). وصمة عار الخلايا عن طريق احتضان مع المضادة CD64، CD11c، CD11b، Cx3Cr1، Ly6C، وMHCII الأجسام المضادة. فرز باستخدام مقياس تدفق FACS، gating لCD11c-CD64+ CD11b+ Cx3Cr1+ Ly6C- الخلايا لتنقية CX3Cr1 (P3 + P4) السكان. Lyse فرز الخلايا لإعداد الحمض النووي الريبي الكلي والكشف عن علامات السيتوكين والليفي (انظر القسم 6 لإعداد الحمض النووي الريبي وcDNA). تحليل التعبير mRNA من علامات الليفية وتحليل السيتوكين الالتهابي من تعليق خلية واحدة معزولة من تنقية المغناطيسي. لتحليل FACS، كتلة الخلايا مع المضادة للماوس CD16/CD32 Fc مانع(جدول المواد)قبل تلطيخ مع الأجسام المضادة ضد علامات السطح أو داخل الخلايا. 5. تحليل قياس التدفق تلطيخ وتحليل سطح الخلية إعادة تعليق 5-10 × 105 خلايا بروبريا لامينا معزولة في 50 مل من المخزن المؤقت FACS (1٪ BSA، 2 MM EDTA في PBS، درجة الحموضة 7.4). حضانة الخلايا مع CD16/CD32 المضادة للماوس(جدول المواد)في تخفيف 1:50 لمنع مستقبلات Fc على الجليد لمدة 10 دقائق. غسل الخلايا مع 500 درجة مئوية من الجليد الباردة FACS العازلة لإزالة غير منضم المضادة CD16/CD32 قبل تلطيخ سطح الخلية. تعليق الخلايا الأحادية للبقع السطحية (106 خلايا/50 مل) مع جسم مضاد يحمل علامة الفلورسنت في 1:100 تخفيف على الجليد لمدة 30 دقيقة لتقييم بروبريا لامينا القولونية. غسل الخلايا المسماة مع 500 درجة مئوية من الجليد الباردة FACS العازلة مرتين لإزالة الأجسام المضادة غير المنضمة. تحليل الخلايا أحادية النووية المسماة عن طريق قياس التدفق. بوابة للعيش، ثم لFSC+SSC+ تليها CD11b+ Cx3Cr1+، ثم تحليل علامات تنشيط الضامة الأخرى بما في ذلك MHCII، CD80، CD86 و CD40. تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا وتحليله لتلطيخ السيتوكين داخل الخلايا، وإصلاح ونفاذية الخلايا الملطخة بالسطح باستخدام تثبيت / نفاذية مجموعة الحلول(جدول المواد)؛ يرجى اتباع تعليمات الشركة المصنعة للحصول على خطوات مفصلة. بوابة خلايا بروبريا لامينا لايف، ثم لFSC+SSC+ تليها CD11b+ Cx3Cr1+IL23+ للكشف عن مستوى الخلايا من IL23 السيتوكين وCD11b+ Cx3Cr1+IL1β+ إلى الكشف عن مستوى داخل الخلايا من السيتوكين IL1β. تلطيخ وتحليل αSMA غسل الخلايا مع المخزن المؤقت FACS مرتين عن طريق الطرد المركزي في 200 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإزالة المخزن المؤقت المثبت الزائد. لتحديد مستوى αSMA، نفاذية الخلايا مع تثبيت / نفاذية الحل كيت(جدول المواد). حضانة الخلايا مع الأجسام المضادة المضادة لαSMA-AF488(جدول المواد)باستخدام 1:1000 تخفيف على الجليد لمدة 30 دقيقة. غسل الخلايا مرتين ومن ثم القيام بتحليل FACS. بوابة لايف، FSC+SSC+ تليها الكشف عن αSMA+ الخلايا في الخلايا القولونية. 6. RNA العزلة، RT-PCR، PCR في الوقت الحقيقي عزل الحمض النووي الريبي من الخلايا النقية MACS أو FACS أو الأنسجة المقتطعة القولون عن طريق تجانس لهم في كاشف استخراج(جدول المواد).ملاحظة: استخدم نظارات السلامة وغيرها من معدات الحماية المختبرية عند العمل مع هذا الكاشف كما هو مهيج الرئة والجلد. العمل بأمان في غطاء محرك السيارة. إضافة 0.5 ميكرولتر من الجليكوجين خالية من RNase من 20 ميكروغرام / مل محلول الجليكوجين(جدول المواد)لتحسين الانتعاش من إجمالي الحمض النووي الريبي قبل التعجيل الحمض النووي الريبي مع إيزوبروبانول. إعادة تعليق بيليه RNA في 50 درجة مئوية من المياه الحرة RNase(جدول المواد)وحضانة في 55 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإذابة الحنك RNA تماما. قراءة تركيزات الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي في 260 نانومتر. توليف cDNA باستخدام 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي ومجموعة توليف النسخ العكسي(جدول المواد). تحليل التعبير الجيني باستخدام 2 ميكرولتر من cDNA كقوالب عن طريق PCR في الوقت الحقيقي. استخدام 96 جيدا PCR لوحة qPCR ماجستير مزيج عدة(جدول المواد). استخدم قيم CT لحساب تغيير الطي لوفرة RNA بعد تطبيع قيم GAPDH/HPRT. 7. النشاف الغربية الأنسجة القولون Lyse باستخدام RIPA lysis العازلة (1٪ NP40). حل lysate البروتين في هلام 8٪ بيس تريس في الجهد المستمر من 80 V. نقل هلام البروتين إلى غشاء (ق) nitrocellulose في العازلة نقل الباردة تعمل في تيار ثابت من 50 ماأ لمدة 2 ساعة في 4 درجة مئوية. منع المناطق غير المحددة على غشاء نقل البروتين باستخدام 5٪ الحليب غير الدهون في TBST (25 mM Tris-HCl، درجة الحموضة 7.4، 1.5 M NaCl، 0.05٪ توين-20) لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. للكشف عن مستويات αSMA، يحضن الغشاء (الغشاء) مع الجسم المضاد للكشف الأولي αSMA عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. غسل الأغشية 3-4 مرات باستخدام TBST في فترات 15 دقيقة. حضانة مع الجسم المضاد الثانوي بـ HRP المترافق (1:10,000) في 5% من الحليب غير الدسم في TBST. تطوير الأغشية باستخدام مجموعة تطوير ECL. تطبيع كثافة إشارة البروتين مع GAPDH كتحكم في التحميل لتحليل قياس الكثافة. 8 – التحليل الإحصائي تحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل البيانات المفضل عن طريق المقارنة بين النوع البري والحيوانات KO. النظر في القيمة P لـ <0.05 كبيرة (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001). استخدم اختبار t للطلاب لاختبار الاختلافات بين مجموعتين واختبار ANOVA للتحليل بين أكثر من مجموعتين.
Representative Results
اعتمدنا نموذج الماوس التهاب القولون TNBS لدراسة وتوضيح الآليات الكامنة وراء التليف المعوي8. هنا، قمنا بإجراء دراسة مفصلة عن دورة زمنية لالتهاب القولون بوساطة TNBS، حيث تم إدارة TNBS بشكل مستقيم أسبوعيا إلى الفئران من النوع البري لمدة تصل إلى ستة أسابيع كما يمثلها تخطيطيا (الشكل 1A). بعد ستة أسابيع من العلاج TNBS، لاحظنا أن أطوال القولون تقصير تدريجيا على مدى العلاج TNBS، من متوسط 5 ± 0.5 سم في مجموعة التحكم إلى 3 ± 0.5 سم في مجموعة TNBS؛ مثل هذا التحليل الكمي لطول القولون يمثل انخفاضا واضحا جدا في طول القولون(الشكل 1ب). للتأكد من أن نموذج مرض TNBS كرون قابل للمقارنة مع نموذج التليف كرون الإنسان ولم يكن قطعة أثرية ذات الصلة بالمنهجية، قمنا بتحليل علامات الليفي على مستويات متعددة في دراسة دورة زمنية مفصلة لحقن TNBS إلى النوع البري . وقد تم الإبلاغ عن تراكم ألفا الملساء العضلات أكتين (αSMA) الخلايا الإيجابية وترسب الكولاجين داخل طبقات تحت المخاطية في معظم حالات التليف ويعتبر سمة مميزة للأحداث الليفية14. وجدنا أن أقسام القولون من الفئران المعالجة TNBS التي كانت ملطخة αSMA أظهرت زيادة 4-6 أضعاف في طبقة تحت المخاطية القولونية ملطخة بشكل إيجابي مع αSMA(الشكل 1C). إلى جانب ذلك، فإن تلطيخ الأزرق ثلاثي الألوان لهذه الأقسام أظهرت أيضا زيادة 2-4 أضعاف، مما يشير إلى ترسب الكولاجين كبيرة، مما يؤكد التليف المعوي الحاد(الشكل 1D). كما قمنا بتقييم تنشيط الخلايا النخاعية من خلال الكشف عن الخلايا الإيجابية αSMA عن طريق تحليل FACS في القولون الفئران المعالجة TNBS ووجدت تراكم كبير من تلطيخ αSMA إيجابية(الشكل 1E). وعلاوة على ذلك، وجدنا تحريضا كبيرا في التعبير عن αSMA، العقيد الأول، وكول-الثالث تقاس بتحليل qPCR في الفئران المعالجة TNBS(الشكل 1F). كشفت زيادة التعبير عن بروتين αSMA في تحليل وصمة عار الغربية زيادة التليف (الشكل 1G). بشكل عام، يوفر العلاج الحركي TNBS فرصة للوصول إلى الاستجابة المناعية المفترضة في الحالات المزمنة، والتي تحاكي عن كثب حالة المرحلة المزمنة CD وضروري لتطوير التليف. لمقارنة التليف TNBS مع التليف كرون المرتبطة بها، قمنا بتحليل التعبير عن علامات التليف والسيتوكينات في خزعة الأنسجة الطازجة من اللفائفي للمرضى الذين يعانون من CD نشط أو تحت مغفرة. بشكل ملحوظ، وجدنا تحريض ملحوظ من سماكة الطبقات الإيجابية αSMA وزيادة ترسب الكولاجين كما تم الكشف عنها عن طريق تلطيخ ثلاثي الألوان في أقسام CD النشطة(الشكل 2A). كما قمنا بتحليل اللطخة الغربية وأكدنا الحث على التعبير αSMA في عينات CD النشطة(الشكل 2B). وبالإضافة إلى ذلك، لاحظنا تحريض كبير من علامات التليف بما في ذلك αSMA، Col1، كما تم الكشف عنها من قبل تحليل qPCR(الشكل 2C). المقبل ، لتحديد آلية للحد من التليف TNBS قمنا بتقييم آثار رابامايسين ، وهو مثبط الدوائية من نشاط mTOR15،16. وبناء على ذلك، قمنا بمعالجة الفئران مع كل من TNBS وrapamycin وتحليل αSMA ومستوى الكولاجين في علم أنسجة القولون وأظهرت القياس الكمي αSMA والكولاجين في مؤامرة قياس الكثافة(الشكل 3A). تشير بياناتنا إلى أن راباميسين يقلل من تلطيخ αSMA الإيجابي في طبقة تحت المخاطية ويقلل من ترسب الكولاجين. لمزيد من التحقق من صحة وتحديد الاستجابات الليفية، حددنا التعبيرات αSMA والكولاجين وTGFβ بواسطة qPCR، والتعبير αSMA عن طريق قياس التدفق في القولون المعالجة TNBS(الشكل 3B، 3C). لقد أظهرنا أيضا Cx3Cr1+ phagocytes أحادية النووية تحفز استجابة مناعية التهابية للإصابة9. وهكذا، أردنا أن نرى ما إذا كانت إدارة راباميسين في الفئران المعالجة TNBS يمكن عكس الآثار الالتهابية والليفية. لذلك، قمنا بتنقية Cx3Cr1+ phagocytes أحادية النووية المقيمة من تعليق الخلايا أحادية القولون باستخدام microbeads المغناطيسي(الشكل 3D). وجدنا زيادة في مستوى p-p70 و P-S6 في Cx3Cr1+ phagocytes أحادية النووية المقيمة عن طريق تحليل وصمة عار الغربية من الفئران المعالجة TNBS، وسدت هذا المستوى من قبل راباميسين (الشكل 3E). إلى جانب ذلك، وجدنا أن العلاج رابامايسين يخفف أسفل IL-23 و IL-1β في المجموعة المعالجة TNBS(الشكل 3F). وعلاوة على ذلك، توضح هذه النتائج الآلية الفعالة التي ينطوي عليها تحريض التليف TNBS وأظهرت أن رابامايسين يخفف من التليف. الشكل 1: يؤدي نجاح إدارة TNBS إلى تطوير التليف المعوي في الفئران. A. الرسم التخطيطي تمثيل العلاج TNBS الأسبوعية المعطاة للفئران البرية من نوع. B. صور القولون وقياس أطوال القولون من الفئران المعالجة TNBS، حصادها في الأسابيع 0، 2، 4، و 6 العلاج بعد TNSB. سي دي تحليل أقسام القولون النسيجي الملون بالأجسام المضادة للαSMA لتنشيط myofibroblasts وتلطيخ الأزرق ثلاثي الألوان للكولاجين. مقياس شريط 100 μm. E. تحليل FACS لتحديد الخلايا الإيجابية αSMA في القولون والقياس الكمي للخلايا الإيجابية αSMA. واو – العلامات الليفية والسيتوكينات التي اكتشفها جهاز الكشف عن طريق الـ qPCR. G. تحليل وصمة عار الغربية من αSMA من الليسات القولون من TNBS المعالجة والسيطرة على الفئران. هذا الرقم المعدل يعاد استخدامه بإذن من المنشور السابق9 في علم المناعة المخاطية، 2019 من قبل ماثور وآخرون. الشكل 2: التليف TNBS هو مماثل للتليف المعوي المرتبط ة كرون. A. الصور التمثيلية للخزعات القولون من السيطرة، CD نشط تظهر زيادة كبيرة في تلطيخ الأزرق ثلاثي الألوان وتلطيخ αSMA إيجابية في طبقات تحت المخاطية، شريط مقياس 50 درجة مئوية. تحليل اللطخة الغربية للتعبير αSMA والقياس الكمي. C. تحليل qPCR من العلامات الليفية والسيتوكينات. هذا الرقم المعدل يعاد استخدامه بإذن من المنشور السابق9 في علم المناعة المخاطية، 2019 من قبل ماثور وآخرون. الشكل 3: علاج رابامايسين يحسن بشكل فعال التليف الناجم عن TNBS. A. تحليل النسيج القولون – الصور التمثيلية من تلطيخ myofibroblast مع الأجسام المضادة لαSMA والكولاجين تلطيخ مع الأزرق ثلاثي الألوان، شريط مقياس 100 م. B. تحليل qPCR من αSMA، الكولاجين وTGFβ التعبير في السيطرة / القولون الماوس المعالجة TNBS. C. تحليل FACS αSMA في تعليق خلية واحدة من القولون الماوس تعامل مع التحكم / TNBS. D. التخطيطي لتنقية Cx3Cr1+ الخلايا من كسر بروبريا لامينا القولونية وتحليل FACS من الخلايا النقية. E. تحليل وصمة عار الغربية من مستويات p-p70 و P-S6 في تطهيرCx3Cr1 + phagocytes أحادية النووية من الفئران المعالجة مع TNBS و / أو راباميسين. F. تحليل qPCR للتعبير في Cx3Cr1 + phagocytes أحادية النووية النقية، والتي تنتج IL-23 و IL-1β. هذا الرقم المعدل يعاد استخدامه بإذن من المنشور السابق9 في علم المناعة المخاطية، 2019 من قبل ماثور وآخرون.
Discussion
التئام الجروح أو إصلاح الأنسجة هي عملية بيولوجية منظمة بإحكام17. أثناء إصابة الأنسجة مع حالة كيميائية وميكانيكية والعدوى، تؤدي الاستجابة الالتهابية إلى عملية إصلاح الأنسجة. ومع ذلك، فإن الاستجابة الالتهابية غير المنظمة والمرضية تؤدي إلى تطوير تندب أو رد فعل ليفي، والتي يمكن أن تضعف وظيفة إصلاح الأنسجة9،18،19. هنا، نعرض الإجراء لنموذج الحيوانات التليف الناجم عن TNBS، الذي يشارك بشكل كبير الفيزيولوجيا المرضية مع مرض كرون البشري. التلقيح المتعاقب للتعرض الكيميائي TNBS للتلف ظهارة الماوس يسبب تقرحات عميقة ويحفز تطور التليف. مع موثوق بها، وانخفاض التكلفة، والحث السريع لبداية المرض، وهذا الأسلوب مقبول على نطاق واسع من قبل مجموعات بحثية متعددة تشارك في دراسات لإصابة الأنسجة، والتهاب عبر جدارية ومحور الأمعاء والدماغ.
لتنفيذ نموذج التليف TNBS بنجاح، هناك العديد من الخطوات الأساسية. على سبيل المثال, جرعة كافية وتوقيت إدارة TNBS مهمة جداً. يسمح تلقيح TNBS لمدة 6-8 أسابيع بتقرح اتّساق الأنسجة العميقة ويوصى به بشدة للدراسات الليفية المزمنة. البراز القادمة من الفئران وردود الفعل الرجعية من TNBS الملقحة هي مشكلتين رئيسيتين، والتي يمكن أن تؤدي إلى تسليم جرعات متغيرة للفئران. قد يساعد الضغط اللطيف بالقرب من المستقيم الفئران الإفراج عن البراز قبل إدارة TNBS. عقد رأس الحيوان إلى أسفل لبضع ثوان يساعد بشكل كبير على وقف الجزر العكسي من TNBS. كما أن إبقاء الفئران في قفص، ووضع القفص على منصة حرارية، وتزويد الفئران برحيق نابا يمكن أن يكون أيضا ً استراتيجيات مفيدة في منع ارتفاع معدل الوفيات.
هنا، نناقش أيضا التهاب الأمعاء خلال التليف TNBS وتأثيرها على الاستجابة الليفية. دور mTOR / autophagy متورط ة على نطاق واسع على التوازن المعوي وفي مسببات الأمراض IBD20،21. حددنا أن الإشارات mTOR/autophagy أمر بالغ الأهمية لتعديل الاستجابات المؤيدة للالتهابات من IL-23 و IL1β cytokines من Cx3Cr1+ الخلايا الفيالضرورية أحادية النووية التي تؤثر على المحور IL-23/IL-22 الموالية للليفي(الشكل 3A)9 . وبالتالي، تنقية Cx3Cr1 واحد+ الخلايا أحادية النووية لتوصيف المناعة والتعبير الجيني هو خطوة حاسمة من النموذج. نناقش بالتفصيل بروتوكول عزل لامينا بروبريا وتوفير إجراء تنقية Cx3Cr1+ الخلايا أحادية النووية باستخدام الخرز المغناطيسي.
بشكل جماعي، على الرغم من وجود نماذج وراثية وعفوية لمرض كرون، لا يزال التهاب القولون TNBS أداة قوية لدراسة مسببات الأمراض المناعية من القرص المضغوط ولديه القدرة على تقييم علاجات التليف كرون. الحد الرئيسي من استخدام نماذج التليف المستحث كيميائيا مثل TNBS هو فرصة لتباين عالية من المستخدم إلى المستخدم وإمكانية الخروج في البيانات. حجم عينة من 5-8 الحيوانات لكل مجموعة جنبا إلى جنب مع تجربة أكبر للمستخدم يمكن أن تزيد من اتساق النموذج. ومع ذلك، فإن العثور على نموذج وراثي مناسب يسبب التليف العفوي كرون هو وسوف يكون دائما مبررا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل منحة NIH R01NS093045 (Y.H.)، ومنحة NIH K08DK088950 (X.Z.)، R03DK099566 (X.Z.)، ومؤسسة كرون وكوليتيز الأمريكية للبحوث زمالة (CCFA) 481637 (R.M.).
Materials
| Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4 | e-bioscience | 53-9760-82 | |
| Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77 | e-bioscience | 149760-80 | |
| Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70 | Biolegend Inc | 101226 | |
| Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11 | Biolegend | 149006 | |
| Anti-mouse purified CD16/32 Fc block | Biolegend Inc | 14-9760-80 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-105-639 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | e-bioscience | 7074 | |
| Bovine Serum Albumin | InvivoGen | tlrl-isdn | |
| Collagenase type IV | Roche | 1088866001 | |
| DAPI | SIGMA | D9542 | |
| DMEM | Corning | 10013-CV | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | D263-5vl | |
| Falcon® 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit | BD Bioscience | 555028 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | www.flowjo.com | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | e-bioscience | 5018 | |
| Graphpad Prism 7 | GraphPad Software Inc | www.graphpad.com | |
| H&E kit | American Mastertech Kit | HXMMHPT | |
| Image J | NIH | www.imagej.nih.gov/ij/ | |
| Mouse: C57BL/6J | Jackson Laboratories | 664 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Percol | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| PMA/Ionomycin salt | Sigma | P8139 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermofisher | A25777 | |
| Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11 | Cell signaling | 5174 | |
| Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7 | Cell signaling | 2708 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371 | Cell signaling | 9208 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E | Cell signaling | 4858 | |
| Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein | Cell signaling | 2217 | |
| Rapamycin | LC LABORATORIES | 1003799 | |
| TNBS | Sigma | 92823 | |
| Trichorme staining kit | American Mastertech Kit | STOSTBPT | |
| TRIzol | Life technologies | 15596018 | |
| Verso cDNA Synthesis Kit | Thermofisher | AB1453B | |
| Zen black 2.1 | Carl Zeiss | www.zeis.com | |
| Zen blue lite 2.3 | Carl Zeiss | www.zeis.com |
References
- Garrett, W. S., Gordon, J. I., Glimcher, L. H. Homeostasis and inflammation in the intestine. Cell. 140, 859-870 (2010).
- Park, S. G., et al. T regulatory cells maintain intestinal homeostasis by suppressing gammadelta T cells. Immunity. 33, 791-803 (2010).
- Speca, S., Giusti, I., Rieder, F., Latella, G. Cellular and molecular mechanisms of intestinal fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18, 3635-3661 (2012).
- Keubler, L. M., Buettner, M., Hager, C., Bleich, A. A Multihit Model: Colitis Lessons from the Interleukin-10-deficient Mouse. Inflammatory Bowel Disease. 21, 1967-1975 (2015).
- Strober, W., Nakamura, K., Kitani, A. The SAMP1/Yit mouse: another step closer to modeling human inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 107, 667-670 (2001).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology-Gastroenterology and Liver Physiology. 296, G135-G146 (2009).
- Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery. 11, 9-15 (2016).
- Loeuillard, E., et al. 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced chronic colitis with fibrosis and modulation of TGF-beta1 signaling. World Journal of Gastroenterology. 20, 18207-18215 (2014).
- Mathur, R., et al. Induction of autophagy in Cx3cr1(+) mononuclear cells limits IL-23/IL-22 axis-mediated intestinal fibrosis. Mucosal Immunology. 12, 612-623 (2019).
- Joeris, T., Muller-Luda, K., Agace, W. W., Mowat, A. M. Diversity and functions of intestinal mononuclear phagocytes. Mucosal Immunology. 10, 845-864 (2017).
- Mathur, R., et al. A mouse model of Salmonella typhi infection. Cell. 151, 590-602 (2012).
- Zhao, X., et al. Noninflammatory Changes of Microglia Are Sufficient to Cause Epilepsy. Cell Reports. 22, 2080-2093 (2018).
- Murugaiyan, G., et al. MicroRNA-21 promotes Th17 differentiation and mediates experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 125, 1069-1080 (2015).
- Hinz, B., Celetta, G., Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Chaponnier, C. Alpha-smooth muscle actin expression upregulates fibroblast contractile activity. Molecular Biology of the Cell. 12, 2730-2741 (2001).
- Yang, J., et al. Rapamycin Inhibition of mTOR Reduces Levels of the Na+/H+ Exchanger 3 in Intestines of Mice and Humans, Leading to Diarrhea. Gastroenterology. 149, 151-162 (2015).
- Mutalib, M., et al. The use of sirolimus (rapamycin) in the management of refractory inflammatory bowel disease in children. Journal of Crohns and Colitis. 8, 1730-1734 (2014).
- Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair at a glance. Journal of Cell Science. 122, 3209-3213 (2009).
- Paul, J., et al. IL-17-driven intestinal fibrosis is inhibited by Itch-mediated ubiquitination of HIC-5. Mucosal Immunology. 11, 427-436 (2018).
- Sohail, I., Ghosh, S., Mukundan, S., Zelewski, S., Khan, M. N. Role of Inflammatory Risk Factors in the Pathogenesis of Streptococcus pneumoniae. Frontiers of Immunology. 9, 2275 (2018).
- Laplante, M., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth control and disease. Cell. 149, 274-293 (2012).
- Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448, 427-434 (2007).
Cite This Article
Mathur, R., Alam, M. M., Zhao, X., Huang, Y., Zhu, X. Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin. J. Vis. Exp. (151), e60067, doi:10.3791/60067 (2019).