Perspicacia mecanicista sobre el desarrollo de la fibrosis intestinal mediada por TNBS y la evaluación de los efectos inhibidores de la rapamicina

Para este manuscrito, todas las muestras humanas fueron adquiridas de acuerdo con el protocolo aprobado por la Junta de Revisión del Instituto (IRB) y por el Comité de Investigación Humana en Albany Medical College. Todas las investigaciones relacionadas con animales fueron seguidas estrictamente de acuerdo con el protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en Albany Medical College, así como el National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals . 1. Recogida de especímenes intestinales humanos Recoger muestras de tejido humano de acuerdo con los protocolos del comité de investigación de la institución. Procurar tejido intestinal (ileocos) de un paciente con CD diagnosticado con fibrosis y controlar muestras de pacientes sin antecedentes de EII. Utilizar parte del tejido intestinal para la inmunohistología, otra parte del tejido para analizar el ARNm y una parte final para la expresión proteica de genes/marcadores fibrososos y citoquinas. Para el análisis de inmunohistología, primero fije la muestra de tejido humano en un 4% de paraformaldehído durante al menos 48 h y luego transfiérala a un tubo que contenga 70% de etanol durante al menos 16 h. Use este tejido fijo para hacer un bloque incrustado en parafina y corte el tejido de 5 m de espesor secciones mediante el uso de un microtome tisular. Con un cepillo, extienda suavemente cada sección cortada en un portaobjetos de vidrio para manchar. Diapositiva de sección de tejido de tinción con tinción tricroma para detectar la deposición de colágeno, y con la mancha de la A.SM para detectar miofibroblastos (ver sección 3 para obtener información detallada sobre el tricromo y la tinción de la AMI). Examine las secciones manchadas bajo un microscopio de luz. Procesar otra parte de la muestra de tejido humano obtenida para hacer lisato proteico para detectar la SSMA a través de la mancha occidental (ver sección 7 para obtener información detallada sobre el análisis de la mancha occidental). Obtenga ARN de la parte final de la muestra de tejido humano utilizando un reactivo de extracción(Tabla de materiales)y convierta el ARNm en ADNc cDNA a través de RT-PCR. Analizar los genes fibrososos y citoquinas por qPCR (ver sección 6 para obtener información detallada sobre la preparación del ARNm). 2. Inducción de fibrosis TNBS y tratamiento con rapamicina en ratones Llevar a cabo la investigación animal de acuerdo con los protocolos de investigación animal aprobados por la institución. Afeitar ratones adultos alrededor de la zona del cuello con el fin de pre-sensibilizar a TNBS a través de la exposición dérmica. Remoje TNBS en un hisopo de algodón y luego aplique TNBS en la zona arasda del cuello del ratón.NOTA: La presensibilización es un paso muy importante, ya que mejora la respuesta de hipersensibilidad retardada para iniciar la inflamación mediada por TNBS. Ocho días después de la presensibilización, inducir la colitis por administración intrarectal una vez a la semana durante seis semanas. Aplicar cuatro mg de TNBS (en 25% de etanol) utilizando un enema de 100 ml a través de una jeringa de 1 ml unida a un catéter de poliuretano francés de 3,5 y dar a los ratones de control 100 ml de etanol al 25%solamente. Anestetizar ratones con pentobarbital (25 mg/kg intraperitoneal) o exponerlos al 2,5% de isoflurano junto con 1 L/min de oxígeno durante la administración de TNBS. Confirme la anestesia pellizcando suavemente los dedos de los dedos de los dedos de los dedos de los ojos y buscando la ausencia de reflejo. Use pomada veterinaria en los ojos para prevenir la sequedad mientras los ratones están bajo anestesia. Inyectar rapamicina a 2 mg/kg/día o vehículo (5% Tween-20 y 4% etanol) todos los días de la semana durante 3-6 semanas, intraperitoneales, tanto a ratones de control como tratados con TNBS. Utilice el intestino de ratones post-tratados TNBS de 6 semanas para analizar los ensayos extracelulares incluyendo histología, citometría de flujo, hinchazón occidental y extracción de ARN. Para cosechar órganos, euthanizar ratones utilizando la inhalación de CO2 y confirmar la eutanasia con luxación cervical. Para cosechar órganos, euthanizar ratones utilizando la inhalación de CO2 y confirmar la eutanasia con luxación cervical. Después de la eutanasia, abra longitudinalmente el ratón en su lado ventral usando tijeras de grado quirúrgico y fórceps. Retire todo el colon del recto hasta el área de ilium terminal. Transfiera rápidamente el colon a 1x HBSS helado y lave el colon con el mismo tampón. Mida y compare las longitudes de dos puntos de los ratones tratados con TNBS y TNBS. Realice este paso lo más rápido posible para evitar el secado de los colones con el fin de evitar muertes celulares. Cortar el colon en trozos pequeños y mantener a -80 oC para su almacenamiento para fines futuros (análisis de ARN/western blot). Utilice otra pieza de los dos puntos para el análisis FACS. Asegúrese de cortar y recoger muestras de tejido colono de regiones similares del colon de animales tratados con TNBS y tratados con TNBS.NOTA: Se espera una mortalidad del 10%-20% con la inoculación del TNBS, aunque con la experiencia, la tasa de mortalidad puede reducirse significativamente. 3. Evaluación inmunohistopatológica de la fibrosis intestinal Fijar los tejidos humanos y/o ratones en 4% paraformaldehído durante 48 h, y luego transferir al 70% de etanol durante 16 h.NOTA: Paraformaldehyde es un producto químico neurotóxico por lo que evitar la inhalación; usar una máscara facial mientras la usas. La parafina incorpora los tejidos fijos del colon, corta a un espesor de 5 m y coloca directamente los tejidos en diapositivas de vidrio para la histología. Realice la tinción H&E y Trichrome Blue de acuerdo con las instrucciones del fabricante para detectar colágeno. Brevemente, primero desparasfina las secciones sumergiendo la diapositiva que contiene secciones en dos cámaras de xileno durante 5 min en cada cámara. Enjuague los portaobjetos con 100% de alcohol durante 1 min; repetir este paso tres veces. Enjuague de nuevo con agua del grifo durante 1 min. Después de eso, sumerja los portaobjetos en la solución precalentada de Bouin a 56 oC durante 60 minutos. lavar después de sacar los toboganes de la solución de Bouin en agua del grifo durante 3 minutos o hasta que los portaobjetos se volvieran incoloros. Sumerja las diapositivas en la solución de hematoxilina de Mayer modificada durante 7 minutos a temperatura ambiente. Se desliza por la mancha sumergiendo en la mancha Trichrome durante 5-8 min. Inmediatamente, enjuague los portaobjetos en agua corriente durante 5-10 s para eliminar el exceso de manchas Trichrome. Deshidratar los portaobjetos con 100% de alcohol durante 1 min. Repita este procedimiento tres veces. Despeje las diapositivas con xileno durante 1 min y repita el paso 3x. Monte los portaobjetos con soporte de montaje(Tabla de materiales). Sostenga cuidadosamente el cubreobjetos en un extremo con fórceps y deje que cubra toda la sección sin tener burbujas. Si hay algunas burbujas, retire rápidamente las burbujas tocando la cubierta. Utilice la inmunomancha para detectar la AMA. Bloquear las secciones de dos puntos en el tampón de bloqueo (0,2% Triton X-100 y 5% de suero normal de cabra en 1x PBS) durante 1 h a temperatura ambiente. Incubar con 100 l de anticuerpo primario diluido para la SMA(Tabla de Materiales)en la solución deslizante (0,2% Triton X-100 y 3% de suero normal de cabra en 1x PBS; anti-SMA 1:200) a 4oC durante la noche. Lave las secciones tres veces con 1x PBS. Utilice IgG antiratón de cabra (H + L) conjugado con Alexa Fluor 488(Tabla de materiales)como anticuerpo secundario durante 2 horas a temperatura ambiente. Lave las secciones tres veces con 1x PBS. Utilice DAPI para contrarrestar el núcleo durante 5 min. Lave las secciones tres veces con 1x PBS. Monte las guías con medios de montaje fluorescentes(Tabla de materiales)y selle con un cubreobjetos con esmalte de uñas. Adquiera imágenes utilizando el microscopio confocal LSM 880 y las imágenes de proceso utilizando el software del microscopio. Cuantifique las imágenes tomando un promedio de varias áreas seleccionadas en la misma sección con ImageJ. 4. Aislamiento de la lámina intestinal y purificación de Cx3Cr1+ fagocitos mononucleares Abra longitudinalmente el colon en la solución de sal equilibrada de Hank (HBSS; Tabla de Materiales) y lavar el colon con el mismo tampón. Corte aproximadamente 5 cm pequeños trozos de tejidos de colon usando tijeras estériles en HBSS. Transfiera piezas de tejido de colon pequeño en un tubo cónico de 50 ml que contenga 10 ml de tampón de predigestión (1x HBSS con 5% FBS, 5 mM EDTA y 1 mM de TDT), y agite durante 20 minutos a 100 rpm en una incubadora de 37 oC11.NOTA: La incubación de tejido colono a 37 oC a 100 rpm de condición de agitación permite una digestión eficiente del tejido de la colagenasa y un alto rendimiento de células viables. Deseche el epitelio colono separado pasando a través de un colador de células de 40 m. Recoger el tejido restante del colador y digerirlos aún más en el tampón de digestión que contiene Colagenasa tipo IV y DNase I(Tabla de Materiales)en 1x HBSS con 5% FBS durante 20 min a 37oC a 100 rpm. Vortex los tejidos digeridos durante aproximadamente 20 s y pasar a través de un colador celular de 40 m para obtener fracciones de propria de lamina. Centrifugar las fracciones de propria de lamina para peletizar las células a 700 x g en 4 oC Para excluir las celdas muertas de la lámina propria utilice un gradiente de densidad(Tabla de materiales).NOTA: Los medios de gradiente de densidad utilizados aquí(Tabla de Materiales)pueden causar la pérdida de células mononucleares; sin embargo, elimina en gran medida las células muertas de la preparación, lo que en general aumenta la pureza. Haga 100 ml cada una de las soluciones de medios de gradiente de densidad del 30% y del 70%. Resuspender las células obtenidas en 10 ml de la solución del 30% y superponerse encima de 5 ml de la solución del 70% en un tubo de 15 ml. Centrifugar el gradiente en un estado libre de frenos a 1.000 x g y a temperatura ambiente. Recoger la fase de anillo blanco que contiene linfocitos propria de lámina, que estará entre las capas de 30% y 70% de gradiente. Lavar las células obtenidas mediante la resuspensión en HBSS helado y centrífuga a 500 x g,20 oC, durante 10 min. Volver a suspender las células en el tampón FACS (clasificación celular activada por fluorescencia) (PBS, pH 7.4, con 1% de BSA y 2 mM EDTA). Purificar los fagocitos mononucleares de la purificación de las células recogidas utilizando perlas magnéticas y/o clasificación FACS. Purificación magnética Antes de la tinción con anticuerpos, primero bloquee la superficie celular de las células de lamina propria incubando con el bloqueador de CD16/CD32 Fc antiratón durante 15 minutos sobre hielo. Incubar células con anticuerpos anti-Cx3Cr1-PE (ficoeritrina) junto con microperlas anti-PE(Tabla de materiales)durante 30 minutos sobre hielo, para capturar las células enlazadas. Lave las células con el tampón FACS. Pase las células enlazadas a anticuerpos/perlas a través de una columna de clasificación de células activada magnéticamente en un campo magnético para eliminar las células no enlazadas. Lávese tres veces con el búfer FACS. Retire la columna del campo magnético y empuje el émbolo en la columna para producir celdas enlazadas con cordón. Clasificación FACSNOTA: La clasificación FACS se puede utilizar en lugar de la purificación magnética. Aunque la purificación magnética es un método fácil y rentable, se limita a purificar solo células individuales, no a subpoblaciones de células. Por lo tanto, para aislar subpoblaciones de células, el método de clasificación FACS es un método eficaz para clasificar celdas individuales, así como subpoblaciones de celdas. Células de lamina propria de bloque con bloqueador antiratón CD16/CD32 Fc (Tabla de materiales). Células de mancha mediante la incubación con anticuerpos anti-CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C y MHCII. Ordenar usando un citómetro de flujo FACS, gating para CD11c-CD64+ CD11b+ Cx3Cr1+ Ly6C- células para purificar la población CX3Cr1 (P3 + P4). Células ordenadas de Lyse para la preparación total del ARN y la detección de marcadores de citoquinas y fibroticos (ver sección 6 para la preparación de ARN y ADNc). Analizar la expresión de ARNm de marcadores fibroticos y el análisis de citoquinas inflamatorias a partir de suspensiones de una sola célula aisladas de purificación magnética. Para el análisis FACS, bloquee las celdas con el bloqueador antiratón CD16/CD32 Fc(Tabla de materiales)antes de manchar con anticuerpos contra marcadores de superficie o intracelulares. 5. Análisis de citometría de flujo Tinción y análisis de superficie celular Resuspenda 5-10 x 105 células de propria de lámina aisladas en 50 ml de tampón FACS (1% BSA, 2 mM EDTA en PBS, pH 7.4). Incubar células con cd16/CD32 antiratón(Tabla de materiales) a una dilución 1:50 para bloquear los receptores Fc en hielo durante 10 min. Lave las células con 500 ml de tampón FACS helado para eliminar el anti-CD16/CD32 no unido antes de la tinción de la superficie celular. Suspensión de una sola célula colónica de mancha superficial (106 células/50 ml) con anticuerpo con etiqueta fluorescente a 1:100 de dilución en hielo durante 30 min para evaluar la lámina propria colónica. Lave las células etiquetadas con 500 ml de tampón DE FACS helado dos veces para eliminar los anticuerpos no unidos. Analizar las células mononucleares etiquetadas por citometría de flujo. Gate for Live, luego para FSC+SSC+ seguido de CD11b+ Cx3Cr1+, y luego analizar otros marcadores de activación de macrófagos incluyendo MHCII, CD80, CD86 y CD40. Tinción y análisis de citoquinas intracelulares Para la tinción de citoquinas intracelulares, fijar y permeabilizar las células teñidas de superficie utilizando un kit de solución de fijación/permeabilización(Tabla de materiales); siga las instrucciones del fabricante para conocer los pasos detallados. Células propria de lámina de puerta para Live, luego para FSC+SSC+ seguida de CD11b+ Cx3Cr1+IL23+ para detectar el nivel intracelular de citoquina IL23 y CD11b+ Cx3Cr1+IL1+ detectar el nivel intracelular de citoquinas IL1. Tinción y análisis de la AMI Lave las células con tampón FACS dos veces centrifugando a 200 x g y 4 oC durante 5 min para eliminar el exceso de tampón fijador. Para determinar el nivel de SMA, permeelice las celdas con un kit de solución de fijación/permeabilización (Tabla de materiales). Incubar células con anticuerpo anti-SMA-AF488(Tabla de Materiales) usando 1:1,000 de dilución en hielo durante 30 min. Lave las células dos veces y luego haga el análisis FACS. Gate for Live, FSC+SSC+ seguido de la detección de células sma+ en células colónicas. 6. Aislamiento de ARN, RT-PCR, PCR en tiempo real Aislar el ARN de las células purificadas MACS o FACS o el tejido extirpado de colon homogeneizándolos en el reactivo de extracción(Tabla de materiales).NOTA: Utilice gafas de seguridad y otros equipos de protección de laboratorio cuando trabaje con este reactivo, ya que es un irritante para el pulmón y la piel. Trabaja con seguridad en una capucha. Añadir 0,5 l de glucógeno libre de RNase a partir de 20 g/ml de solución de glucógeno(Tabla de materiales)para mejorar la recuperación del ARN total antes de precipitar el ARN con isopropanol. Resuspender el pellet de ARN en 50 ml de agua libre de RNase(Tabla de Materiales)e incubar a 55 oC durante 5 min para disolver completamente el paladar de ARN. Lea las concentraciones de ARN utilizando un espectrofotómetro a 260 nm. Sintetice el ADNc utilizando 1 g de ARN total y un kit de síntesis de transcripción inversa(Tabla de materiales). Analice la expresión génica utilizando 2 l de ADNc como plantillas a través de PCR en tiempo real. Utilice un kit qPCR Master Mix de placa PCR de 96 pocillos(Tabla de materiales). Utilice los valores CT para calcular el cambio de plegado de la abundancia de ARN después de normalizar los valores GAPDH/HPRT. 7. Hincha occidental Tejido de colon Lyse mediante el uso de tampón de lisis RIPA (1% NP40). Resolver el lisado proteico en un 8% bis-Tris gel a una tensión constante de 80 V. Transfiera la proteína de gel a la membrana(s) de nitrocelulosa en tampón de transferencia en frío que corría a una corriente constante de 50 mA durante 2 h a 4 oC. Bloquear regiones no específicas en la membrana transferida a proteínas utilizando 5% de leche sin grasa en TBST (25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1.5 M NaCl, 0.05% Tween-20) durante al menos 1 h a temperatura ambiente. Para detectar los niveles de SMA, incubar la(s) membrana(s) con el anticuerpo de detección primaria de la A. SMA a 4 oC durante la noche. Lave las membranas 3-4 veces usando TBST en intervalos de 15 minutos. Incubar con anticuerposecundario conjugado en HRP (1:10.000) en leche sin grasa al 5% en TBST. Desarrollar membranas utilizando un kit de desarrollo de ECL. Normalizar las intensidades de la señal proteica con GAPDH como control de carga para el análisis de densitometría. 8. Análisis estadístico Analice los datos utilizando el software de análisis de datos de elección comparando entre el tipo salvaje y los animales KO. Considere que el valor P de <0.05 es significativo (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001). Utilice la prueba t de Student para probar las diferencias entre dos grupos y la prueba ANOVA para su análisis entre más de dos grupos.