TNBS Aracılı Intestinal Fibrozis Gelişimi ve Rapamisin Inhibitör Etkilerinin Değerlendirilmesi Üzerine Mekanistik Bakış
1Department of Molecular and Cellular Physiology,Albany Medical College, 2The IBD Center, Division of Gastroenterology, Department of Medicine,Albany Medical College, 3Department of Geriatrics, School of Medicine and Health Science,University of North Dakota, 4Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics,Albany Medical College
Summary
Bu çalışmada, Crohn fibrozisi ile karşılaştırılabilir patofizyoloji sergileyen TNBS aracılı intestinal fibrozisin ayrıntılı bir prosedürünü açıklıyoruz. Biz de rapamisin bağırsak fibrozis üzerinde inhibitör etkileri kolaylaştırılan ışığında bu yaklaşımı tartışmak.
Abstract
Bağırsak fibrozisinin etkin yönetimini anlamak için önemli çalışmalar yapılmıştır. Ancak, fibrozis daha iyi bilgi eksikliği önleyici bir ilacın gelişimini engellemiştir. Öncelikle, uygun bir hayvan modeli bulmak Crohn ilişkili bağırsak fibrozis patolojimekanizmasını anlamak zor. Burada, fare rektumlarına TNBS kimyasal maruziyetinin önemli ölçüde derin ülserasyon ve kronik inflamasyon ürettiği ve farelerde kronik olarak bağırsak fibrozisi geliştiği etkili bir yöntem benimsedik. Ayrıca, rapamisin enjeksiyonu fare modelinde TNBS aracılı fibrozis üzerinde inhibitör etkileri gösteren bir teknik tarif. Fibrozisin altta yatan mekanizmasını değerlendirmek için, TNBS ile tedavi edilen ve kontrol edilen farelerin lamina proprisinden Cx3Cr1+ hücrelerini arındırma prosedürünü metodik olarak tartışıyoruz. Bu ayrıntılı protokol fibrozis mekanizması nı araştıran ve Crohn ilişkili bağırsak fibrozisiçin daha iyi bir terapötik buluş bulmak için yol açmak araştırmacılar için yararlı olacaktır.
Introduction
Bağırsakta immün homeostaz disregülasyonu patojenik inflamasyona yol açar ve yaygın inflamatuar barsak hastalığına neden olduğu bilinmektedir (IBD)1,2. Intestinal fibrozis, Crohn hastalığı (CD)3gibi inflamatuar barsak hastalıklarının (IBD) kronik bir sonucudur. CD’nin geri dönüşümsüz patofizyolojisi, tedavi seçeneklerini sınırlayan ve şu anda mevcut ilaç bulunmayan fibrozisin intestinal darlığı veya darlığı içerir ve tek tedavi cerrahidir. Sonuçta, uygunsuz inflamasyon ait etkili tedavilerin geliştirilmesi çok CD mekanizması nı incelemek için gereklidir, ve bu bize bir adım daha yakın götürecektir.
Genetik fare modelleri çeşitli IL10 KO, SAMP / Yit ve scid fareleriçinecd45+RB yüksek hücre transferi 4 ,5,6dahil IBD çalışmak için kullanılabilir . Burada, CD’nin fare modelinde TNBS aracılı fibrozis prosedürünü gösteriyoruz, bu da insan Crohn fibrozisinin patolojisi ile karşılaştırılabilir. TNBS kaynaklı modelin bazı avantajları vardır. Bu model teknik olarak basittir; hastalık başlangıcı hızlı, ucuz, ve yaygın olarak farklı hayvanlarda kullanılabilir (örneğin, fare, sıçan ve kobay7). Etanol ve TNBS co-administration (2,4,6-trinitrobenzene sülfonik asit) aniden bağırsak bariyerine zarar verir ve TNBS kolon doku proteini ortaya çıkarır ve önemli immünolojik yanıtlar ortaya çıkarmak8,9. TNBS tekrarlanan maruz iflamasyon ve yaralanmayanıt bir aşırı reaktif onarım sürecine yol açar, ve bağırsakta bir fibrotik reaksiyon gelişir. Böylece, TNBS kaynaklı fibrozis modeli Crohn ilişkili bağırsak fibrozisi çalışma için çok zorlayıcı bir model olmak için hizmet vermektedir.
Ayrıca, mononükleer fagositlerbağırsaktapatogenez ve yaralanmaya doğuştan gelen bağışıklık yanıtı tahkim birincil hücrelerdir 10,11,12,13. Hücresel mekanizmayı açıklamak ve TNBS fibrozis modelinde Cx3Cr1+ mononükleer fagositlerin rolünü belirlemek için mononükleer fagositlerin arındırılması prosedürünü gösteriyoruz. Cx3Cr1+ hücrelerinanalizi inflamatuar belirteçleri değerlendirmek ve bağırsak fibrozisi için eşlik eden mekanizmayı belirlemek için önemli bir adımdır. Topluca, TNBS fibrozis için bu ayrıntılı prosedür bağırsak fibrozis hücresel mekanizmaları açıklamak için yararlı olacaktır.
Protocol
Bu makale için, tüm insan örnekleri Enstitü İnceleme Kurulu (IRB) ve Albany Tıp Koleji İnsan Araştırma Komitesi tarafından onaylanan protokole göre temin edildi. Albany Tıp Koleji Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Için Ulusal Sağlık Enstitüleri Rehberi tarafından onaylanan protokole göre hayvanlarla ilgili tüm araştırmalar sıkı bir şekilde takip edilmiştir. . 1. İnsan bağırsak örneklerinin toplanması Kurumun araştırma komitesi protokollerine göre insan doku örnekleri toplayın. Fibrozis tanısı konmuş bir CD hastasının bağırsak dokusunu (ileocolonic) temin etmek ve IBD öyküsü olmayan hastalardan alınan kontrol örneklerini kontrol etmek. İmmünohistoloji için bağırsak dokusunun bir kısmını, mRNA’yı analiz etmek için dokunun bir kısmını ve fibrotik ve sitokin genlerinin/belirteçlerinin protein ekspresyonu için son bir parçayı kullanın. İmmünohistoloji analizi için, ilk olarak insan doku örneğini en az 48 saat boyunca %4 paraformaldehit halinde düzeltin ve sonra en az 16 saat boyunca etanol içeren bir tüpe aktarın. bir doku-mikrotom kullanarak kesitler. Bir fırça kullanarak, boyama için cam bir slayt üzerinde her kesim bölümü yavaşça yayıldı. Kollajen birikimini saptamak için trikrom lekeli leke dokusu kesiti ve miyofibroblastları saptamak için αSMA lekesi ile (Trikrom ve αSMA boyama hakkında ayrıntılı bilgi için bölüm 3’e bakınız). Lekeli bölümleri ışık mikroskobu altında inceleyin. Elde edilen insan doku örneğinin başka bir kısmını, αSMA’yı batı blotu ile saptamak için protein lisate yapmak için işleyin (batı leke analizi hakkında ayrıntılı bilgi için bölüm 7’ye bakın). İnsan doku örneğinin son kısmından bir ekstraksiyon reaktifi(Malzeme Tablosu)kullanarak RNA alın ve RT-PCR ile mRNA’yı cDNA’ya dönüştürün. Fibrotik ve sitokin genlerini qPCR ile analiz edin (mRNA hazırlığı hakkında ayrıntılı bilgi için bölüm 6’ya bakın). 2. Farelerde TNBS fibrozis ve rapamisin tedavisiin indüksiyonu Kurum tarafından onaylanan hayvan araştırma protokollerine göre hayvan araştırması yapmak. Dermal maruziyet yoluyla TNBS’ye önceden duyarlı olmak için boyun bölgesinin etrafında yetişkin fareleri tıraş edin. TNBS’yi pamuklu bir bezle ıslatın ve fare boynunun tıraşlı bölgesine TNBS uygulayın.NOT: TNBS aracılı iltihabı başlatmak için gecikmiş aşırı duyarlılık yanıtını iyileştirdiğinden ön sensitizasyon çok önemli bir adımdır. Sekiz gün ön sensitizasyon sonrası, altı hafta boyunca haftada bir kez intra-rektal yönetim tarafından kolit neden. 3,5 Fransız poliüretan kateterine bağlı 1 mL şırınga ile 100 μL enema kullanarak dört mg TNBS ( etanol) uygulayın ve kontrol farelerine sadece etanol 100 μL verin. Pentobarbital (25 mg/kg intraperitoneal) ile fareleri anestezi kin hale getirin veya TNBS uygulaması sırasında 1 L/dk oksijenle birlikte %2,5 isoflurana maruz bırakın. Ayak parmaklarını hafifçe çimdikleyerek ve refleks yokluğu arayarak anesteziyi onaylayın. Fareler anestezi altında iken kuruluk önlemek için gözlerde veteriner merhem kullanın. Rapamisin enjekte 2 mg/kg/gün veya araç (%5 Ara-20 ve% 4 etanol) hafta içi her gün 3-6 hafta, intraperitoneal, hem kontrol ve TNBS tedavi fareler. Histoloji, akış sitometrisi, batı lekeleme ve RNA ekstraksiyonu gibi hücre dışı tahlilleri analiz etmek için 6 haftalık tnbs tedavi sonrası fare bağırsağı kullanın. Organları hasat etmek için, CO2 inhalasyon kullanarak fareler ötenazi ve servikal çıkış ile ötenazi onaylamak. Organları hasat etmek için, CO2 inhalasyon kullanarak fareler ötenazi ve servikal çıkış ile ötenazi onaylamak. Ötenaziden sonra, cerrahi sınıf makas ve forceps kullanarak ventral tarafında fareyi uzunlamasına açın. Terminal ilium alana rektum dan tüm kolon çıkarın. Hızlı bir şekilde buz gibi 1x HBSS kolon aktarın ve aynı tampon kullanarak kolon yıkayın. Kontrol ve TNBS ile tedavi edilen farelerin kolon uzunluklarını ölçün ve karşılaştırın. Hücre ölümlerini önlemek için kollar dışında kurumasını önlemek için mümkün olduğunca hızlı bu adımı yapın. Kolonküçük parçalar halinde kesin ve gelecekte (RNA / batı leke analizi) depolama için -80 °C’de tutun. FACS analizi için kolon başka bir parça kullanın. Hem kontrol hem de TNBS ile tedavi edilen hayvanların kolon benzer bölgelerinden kolon doku örnekleri kesmek ve toplamak emin olun.NOT: TNBS aşısı ile -20 mortalite beklenmektedir, ancak deneyimle mortalite oranı önemli ölçüde azaltılabilir. 3. Bağırsak fibrozisinin immüno-histopatolojik değerlendirilmesi 48 saat için % 4 paraformaldehit insan ve / veya fare dokuları düzeltmek ve daha sonra 16 saat için% 70 etanol aktarın.NOT: Paraformaldehit bir nörotoksik kimyasaldır bu yüzden teneffüs önlemek; kullanırken bir yüz maskesi kullanın. Parafin sabit kolon dokularını gömün, 5 μm kalınlığa dilim, ve doğrudan histoloji için cam slaytlar üzerine dokuları koymak. Kollajeni tespit etmek için üreticinin talimatlarına göre H&E ve Trichrome Blue boyama yapın. Kısaca, ilk her odada 5 dakika ksilenin iki odalarında bölümleri içeren slayt batırarak bölümleri deparafinize. 1 dakika boyunca % 100 alkol ile durula slaytlar; bu adımı üç kez tekrarlayın. 1 dakika musluk suyu ile tekrar durulayın. Bundan sonra, 60 dk. Bouin çözeltisi için 56 °C’de önceden ısıtılmış Bouin çözeltisi slaytlar batırın görünümünde sarı; 3 dakika musluk suyunda Bouin çözeltisi slaytlar çıkardıktan sonra yıkayın veya slaytlar renksiz hale gelene kadar. Oda sıcaklığında 7 dakika boyunca Modifiye Mayer’s Hematoksin çözeltisi slaytlar batırın. 5-8 dk. Hemen, fazla Trikrom leke kaldırmak için 5-10 s akan suda slaytlar durulayın Trichrome leke batırarak leke slaytlar. 1 dk. 1 dakika boyunca 0 alkol içeren dehidrat slaytlar. 1 dk ksilen ile slaytlar temizleyin ve adım 3x tekrarlayın. Montaj ortamına sahip slaytlara monte etmek (Malzeme Tablosu). Dikkatle forceps ile bir ucunda coverslip tutun ve herhangi bir kabarcıklar kalmadan tüm bölümü kapsayacak şekilde izin. Bazı kabarcıklar varsa, hızlı bir şekilde coverslip dokunarak kabarcıklar kaldırın. αSMA’yı saptamak için immünoboyama kullanın. Blok kolon bölümleri bloke tampon (0.2% Triton X-100 ve 5% normal keçi serumu 1x PBS) oda sıcaklığında 1 saat için. Slayt çözeltisi üzerinde αSMA(Malzeme Tablosu)için 100 μL seyreltilmiş primer antikor (%0.2 Triton X-100 ve 1x PBS’de %3 normal keçi serumu; anti-αSMA 1:200) ile bir gecede tüplü olarak inkütün. Bölümleri 1x PBS ile üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca ikincil bir antikor olarak Alexa Fluor 488(Malzeme Tablosu)ile konjuge keçi anti-fare IgG (H + L) kullanın. Bölümleri 1x PBS ile üç kez yıkayın. 5 dakika boyunca çekirdek karşı leke DAPI kullanın. Bölümleri 1x PBS ile üç kez yıkayın. Floresan montaj ortamı(Malzeme Tablosu)ile montaj slaytlar ve oje kullanarak bir coverslip ile mühür. LSM 880 konfokal mikroskobu kullanarak görüntüleri edinin ve mikroskop yazılımı kullanarak görüntüleri işleyin. ImageJ ile aynı bölümde birden çok seçili alanın ortalamasını alarak görüntüleri ölçün. 4. Bağırsak lamina propriasının izolasyonu ve Cx3Cr1+ mononükleer fagositlerin saflaştırılması Uzunlamasına buz gibi Hank’s Balanced Tuz Çözeltisi (HBSS) kolon açık; Malzeme Tablosu) ve aynı tampon ile kolon yıkayın. HBSS steril makas kullanarak kolon dokularının yaklaşık 5 cm küçük parçalar kesin. 10 mL’lik sindirim öncesi tampon (1x HBSS % 5 FBS, 5 mM EDTA ve 1 mM DTT ile 1x HBSS) içeren 50 mL konik tüpteki küçük kolon doku parçalarını aktarın ve 37 °C inkübatör11’de100 rpm’de 20 dakika sallayın.NOT: Kolon dokusunun 37 °C’de 100 rpm sallayarak inkübasyon etkin kollajenaz doku sindirimve canlı hücrelerin yüksek verim sağlar sallayarak sağlar. 40 μm hücreli süzgeçten geçerek müstakil kolon epitelini atın. Süzgeçten kalan dokuyu toplayın ve 100 rpm’de 37 °C’de 20 dk için %5 FBS ile 1x HBSS’de Kollajenaz tip IV ve DNase I(Malzeme Tablosu)içeren sindirim tamponunda daha fazla sindirin. Girdap yaklaşık 20 s sindirilmiş dokular ve lamina propria fraksiyonları elde etmek için 40 μm hücresüz geçmek. Lamina propria fraksiyonlarını 4 °C’de 700 x g’de hücreleri aşağı yaslamak için santrifüj Lamina propria ölü hücreleri dışlamak için bir yoğunluk gradyanı kullanın (Malzeme Tablosu).NOT: Burada kullanılan yoğunluk gradyan ortamı(Malzeme Tablosu)mononükleer hücrelerin kaybına neden olabilir; ancak, büyük ölçüde genel saflığı artırır hazırlık, ölü hücreleri kaldırır. Her biri ve yoğunlukgradyan ortam çözümlerinin 100 mL’ini yapın. Elde edilen hücreleri 10 mL’lik 30 çözeltinin 10 mL’sinde yeniden askıya alın ve 15 mL’lik bir tüpteki çözeltinin 5 mL’inin üzerine bindirme. 1.000 x g ve oda sıcaklığında frensiz bir durumda degradeyi santrifüj edin. Lamina propria lenfositler içeren beyaz halka faztoplamak, hangi arasında olacak 30% ve 70% gradyan katmanları. Elde edilen hücreleri 500 x g, 20 °C’de buz gibi HBSS ve santrifüjde yeniden askıya alarak yıkayın, 10 dakika. FACS (floresan-aktive hücre sıralama) tampon (PBS, pH 7.4, %1 BSA ve 2 mM EDTA) hücreleri yeniden askıya alın. Manyetik boncuklar ve/veya FACS sıralamasını kullanarak toplanan hücrelerden mononükleer fagositleri arındırın. Manyetik arınma Antikorlarla boyanmaya başlamadan önce, lamina propria hücrelerinin ilk blok hücre yüzeyi anti-mouse CD16/CD32 Fc bloker ile 15 dakika buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Anti-Cx3Cr1-PE (phycoerythrin) antikorları ile birlikte anti-PE mikroboncuklar ile inkübat hücreler(Tablo Malzemeler) buz üzerinde 30 dakika, bağlı hücreleri yakalamak için. Hücreleri FACS arabelleğiyle yıkayın. Bağlanmamış hücreleri kaldırmak için antikor/boncuk bağlı hücreleri manyetik alandaki manyetik hücre sıralama sütunundan geçirin. FACS arabelleği ile üç kez yıkayın. Sütunu manyetik alandan çıkarın ve boncuk bağlı hücreler elde etmek için sütundaki pistonu itin. FACS sıralamaNOT: FACS sıralama manyetik arıtma yerine kullanılabilir. Manyetik arınma kolay ve uygun maliyetli bir yöntem olsa da, hücrelerin alt popülasyonları için değil, sadece tek hücreleri arındırıcı ile sınırlıdır. Bu nedenle, hücrelerin alt popülasyonlarını izole etmek için, FACS sıralama yöntemi tek hücrelerin yanı sıra hücrelerin alt popülasyonlarını sıralamanın etkili bir yöntemidir. Anti-fare CD16/CD32 Fc bloker(Malzeme Tablosu)ile lamina propria hücreleri bloke . Anti-CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C ve MHCII antikorları ile kuluçkaya yatırılarak hücreleri lekeler. CX3Cr1 (P3 + P4) popülasyonundan arındırmak için CD11c-CD64 + CD11b+ Cx3Cr1+ Ly6C- hücreleri için gating, bir FACS akış sitometresi kullanarak sıralama. Toplam RNA hazırlığı için lyse sıralanmış hücreler ve sitokin ve fibrotik belirteçleri saptamak (RNA ve cDNA hazırlığı için bölüm 6’ya bakınız). Manyetik arıtmadan izole tek hücreli süspansiyonlardan fibrotik belirteçlerin ve inflamatuar sitokin analizinin mRNA ekspresyonunu analiz edin. FACS analizi için, yüzey veya hücre içi belirteçlere karşı antikorlarla boyamadan önce anti-mouse CD16/CD32 Fc blokerlihücreleribloke edin. 5. Akış sitometri analizi Hücre yüzeyi boyama ve analizi FACS tamponunun 50 mL’sinde 5-10 × 105 izole lamina propria hücresi (%1 BSA, PBS’de 2 mM EDTA, pH 7.4). 1:50’de anti-mouse CD16/CD32(Malzeme Tablosu)ile hücreleri 10 dakika boyunca buz üzerinde Fc reseptörlerini engellemek için inkübat. Hücre yüzeyi boyamadan önce bağlanmamış anti-CD16/CD32’yi temizlemek için hücreleri 500 μL buz gibi FACS tamponuyla yıkayın. Yüzey leke kolon tek hücreli süspansiyonlar (106 hücre/ 50 mL) floresan etiketli antikor ile 1:100 buz üzerinde seyreltme 30 dk kolon lamina propria değerlendirmek için. Etiketlenmiş hücreleri 500 μL buz gibi FACS tamponuyla iki kez yıkayın ve bağlanmamış antikorları temizler. Akış sitometrisi ile etiketli mononükleer hücreleri analiz edin. Live için Kapı, sonra FSC+SSC+ CD11b+ Cx3Cr1+takip ve sonra MHCII, CD80, CD86 ve CD40 dahil olmak üzere diğer makrofaj aktivasyon işaretleri analiz. Hücre içi sitokin boyama ve analizi Hücre içi sitokin boyama için, sabitleme / Permeabilization Çözüm Kiti(Malzeme Tablosu)kullanarak yüzey lekeli hücreleri düzeltmek ve permeabilize; ayrıntılı adımlar için üreticinin talimatlarına uyun. Live için gate lamina propria hücreleri, daha sonra FSC+SSC+ cd11b+ Cx3Cr1+IL23+ IL23 + IL23 sitokin ve CD11b + Cx3Cr1+ IL1β+ hücre içi seviyesini tespit etmek için takip IL1β sitokin hücre içi düzeyini algılar. αSMA boyama ve analizi Fazla fiksatif tamponu temizlemek için hücreleri 200 x g ve 4 °C’de 5 dakika santrifüj ederek iki kez FACS arabelleği ile yıkayın. αSMA düzeyini belirlemek için, hücreleri Fiksasyon/Permeabilizasyon Çözüm Kiti(Malzeme Tablosu)ile geçirin. 30 dakika boyunca buz üzerinde 1:1.000 seyreltme kullanarak anti-αSMA-AF488 antikor(Malzeme Tablosu)ile inkübat hücreleri. Hücreleri iki kez yıkayın ve sonra FACS analizi yapın. Live için Kapı, FSC+SSC+ kolon hücrelerinde αSMA+ hücrelerinin tespiti takip. 6. RNA yalıtımı, RT-PCR, gerçek zamanlı PCR RNA’yı MACS veya FACS saflaştırılmış hücrelerden veya kolon eksişinli dokudan ekstraksiyon reaktifinde homojenize ederek izole edin (Malzeme Tablosu).NOT: Akciğer ve deri tahriş edici olduğu için bu reaktifle çalışırken güvenlik gözlükleri ve diğer laboratuvar koruyucu donanımlarını kullanın. Bir başlık içinde güvenli bir şekilde çalışın. 20 g/mL glikojen stok çözeltisinden(Malzeme Tablosu)0,5 μL RNa’yı ilave edin ve rna’yı isopropanol ile çökertmeden önce iyileştirin. RNA peletini 50 μL’lik RNase serbest suda(Malzeme Tablosu)yeniden askıya alın ve RNA damağı tamamen eritmek için 55 °C’de 5 dk kuluçkaya yatırın. RNA konsantrasyonlarını 260 nm’de bir spektrofotometre kullanarak okuyun. CDNA’yı 1 μg toplam RNA ve ters transkripsiyon sentez kiti(Tablo Malzemeler)kullanarak sentezleyin. Gen ekspresyonunu 2 μL cDNA kullanarak gerçek zamanlı PCR ile şablon olarak analiz edin. 96-iyi PCR plaka qPCR Master Mix kiti(Malzeme Tablosu)kullanın. GAPDH/HPRT değerlerini normale döndürettikten sonra RNA bolluğunun kıvrım değişimini hesaplamak için CT değerlerini kullanın. 7. Batı lekeleme RIPA lysis tampon (%1 NP40) kullanılarak lyse kolon dokusu. V’lik sabit voltajda protein lisatını %8 bis-Tris jelile çözün. 4 °C’de 2 saat boyunca 50 mA sabit bir akımla çalışan soğuk transfer tamponunda jel-proteini nitroselüloz membrana(lar) aktarın. Oda sıcaklığında en az 1 saat süreyle TBST’de (25 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1.5 M NaCl, %0.05 Ara-20) %5 yağsız süt kullanarak protein transfer membranı üzerindeki spesifik olmayan bölgeleri bloke edin. αSMA düzeylerini saptamak için, bir gecede 4 °C’de αSMA primer algılama antikoru ile inkübat membran(lar). 15 dk aralıklarla TBST kullanarak membranları 3-4 kez yıkayın. TBST’de %5 yağsız sütte HRP konjuge sekonder antikor (1:10.000) ile kuluçka. ECL geliştirme kiti kullanarak membranlar geliştirin. Densitometri analizi için yükleme kontrolü olarak GAPDH ile protein sinyali yoğunluklarını normalleştirin. 8. İstatistiksel analiz Vahşi tip ve KO hayvanlar arasında karşılaştırarak tercih edilen veri analizi yazılımını kullanarak verileri analiz edin. <0.05'in P değerini önemli olarak düşünün (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001). İki grup arasındaki farkları test etmek için Öğrenci’nin t-testini ve ikiden fazla grup arasındaki analiz için ANOVA testini kullanın.
Representative Results
Biz çalışma ve bağırsak fibrozis8altta yatan mekanizmaları açıklamak için TNBS kolit fare modeli benimsemiştir. Burada, TNBS aracılı kolitin ayrıntılı bir zaman kursu çalışması yaptık ve burada TNBS, şematik olarak temsil edildiği üzere altı haftaya kadar yabani farelere haftalık olarak doğru orantılı olarak yönetildi (Şekil 1A). Altı haftalık Tüberküloz tedavisinden sonra, kolon uzunluklarının TNBS tedavisi boyunca, kontrol grubunda ortalama 5 ± 0,5 cm’den TNBS grubunda 3 ± 0,5 cm’ye kadar kademeli olarak kısaldığını fark ettik; kolon uzunluğunun bu nicel analizi kolon uzunluğunda çok belirgin bir azalma dır (Şekil 1B). TNBS Crohn hastalığı modelinin insan Crohn fibrozis modeliile karşılaştırılabilir olduğundan ve metodolojiile ilgili bir obje olmadığından emin olmak için, yabani tipe TNBS enjeksiyonu için yapılan ayrıntılı bir zaman kursu çalışmasında fibrotik belirteçleri birden fazla düzeyde analiz ettik. . Fibrozis insidansının çoğunda alfa-düz kas aktinin (αSMA) pozitif hücrelerin ve kollajen birikiminin birikmesi bildirilmiştir ve fibrotik olaylar için bir işaret olarak kabul edilir14. ΑSMA ile boyanmış TNBS ile tedavi edilen farelerin kolon bölümlerinin αSMA(Şekil 1C)ile pozitif olarak boyanmış kolon submukoza tabakasında 4-6 kat artış gösterdiğini bulduk. Ayrıca, Bu bölümler için Trikrom mavi boyama da 2-4 kat artış gösterdi, önemli kollajen birikimi düşündüren, hangi ciddi bağırsak fibrozisdoğrular (Şekil 1D). TNBS ile tedavi edilen fare kolonlarında FACS analizi ile αSMA-pozitif hücreleri tespit ederek miyofibroblastların aktivasyonunu değerlendirdik ve αSMA-pozitif boyamada önemli bir birikim tespit ettik(Şekil 1E). Ayrıca, TNBS ile tedavi edilen farelerde qPCR analizi ile ölçülen αSMA, Col-I ve Col-III ekspresyonunda önemli indüksiyon saptandı (Şekil 1F). Batı leke analizinde αSMA proteininin artmış ekspresyonu fibroziste artış saptanmıştır (Şekil 1G). Genel olarak, TNBS kinetik tedavisi kronik koşullarda putatif bağışıklık yanıtı erişmek için bir fırsat sağlar, hangi yakından CD kronik faz durumu taklit ve fibrozis gelişimi için gereklidir. TNBS fibrozisini Crohn’un ilişkili fibrozisi ile karşılaştırmak için, aktif CD’li veya remisyon altında olan hastaların ileum’dan taze doku biyopsisinde fibrozis belirteçleri ve sitokinlerin ekspresyonunu analiz ettik. Dikkat çekici bir şekilde, αSMA-pozitif tabakaların kalınlaşmabelirgin indüksiyonu ve aktif CD bölümlerinde trikrom boyama ile tespit edilen kollajen birikiminin arttığını tespit ettik(Şekil 2A). Ayrıca Batı blot analizi ni yaptık ve aktif CD örneklerinde αSMA ekspresyonunun indüksiyonuna doğrulandı (Şekil 2B). Buna ek olarak, qPCR analizi(Şekil 2C)ile saptanan αSMA, Col1 gibi fibrozis belirteçlerinin anlamlı indüksiyonu gözlendi. Sonra, TNBS fibrozis sınırlamak için bir mekanizma belirlemek için rapamisin etkilerini değerlendirdi, mTOR aktivitesinin farmakolojik inhibitörü15,16. Buna göre, fareleri hem TNBS hem de rapamisin ile tedavi ettik ve kolon histolojisinde αSMA ve kollajen düzeyini analiz ettik ve densitometri çiziminde αSMA ve kollajenin nicel ölçümünü gösterdik (Şekil 3A). Verilerimiz rapamisinin submukozal tabakadaki αSMA-pozitif lekelenmeyi azalttığını ve kollajen birikimini azalttığını göstermektedir. Fibrotik yanıtları doğrulamak ve ölçmek için qPCR ile αSMA, kollajen ve TGFβ ekspresyonları ve TNBS ile tedavi edilen kolonda akış sitometrisi ile αSMA ekspresyonu saptandı(Şekil 3B, 3C). Ayrıca Cx3Cr1+ mononükleer fagositleryaralanma9 inflamatuar bağışıklık yanıtı indüklemek göstermiştir. Böylece, TNBS ile tedavi edilen farelerde rapamisin uygulanmasının inflamatuar ve fibrotik etkileri tersine çevirip tersine çeviremeyeceğini görmek istedik. Bu nedenle, manyetik mikroboncuklar kullanarak kolon tek hücreli süspansiyonlardan Cx3Cr1+ yerleşik mononükleer fagositleri arındırdık (Şekil 3D). TNBS ile tedavi edilen farelerden batı leke analizi ile Cx3Cr1+ yerleşik mononükleer fagositlerde p-p70 ve p-S6 düzeylerinde artış saptandı ve bu seviye rapamisin tarafından engellendi (Şekil 3E). Ayrıca, rapamisin tedavisinin TNBS ile tedavi edilen grupta IL-23 ve IL-1β’yi azalttAdığını bulduk (Şekil 3F). Ayrıca bu bulgular TNBS-fibrozisin indüksiyonunda etkili mekanizmayı açıklığa kavuşturmuş ve rapamisinin fibrozisin indüksiyonunu zayıflattını göstermiştir. Şekil 1: Başarılı Tüberküloz uygulaması farelerde intestinal fibrozis gelişmesine yol açar. A. Yabani tip farelere verilen haftalık TNBS tedavisinin şematik diyagramı gösterimi. B. Kolon görüntüleri ve TNBS tedavi farelerden kolon uzunluklarının ölçümü, hafta 0 hasat, 2, 4, ve 6 post-TNSB tedavi. C-D. Miyofibroblastların aktivasyonu için anti-αSMA antikor ve kollajen için trikrom mavi boyama için kolon kesitlerinin histolojik analizi; ölçek çubuğu 100 μm. E. KOLONdaki αSMA pozitif hücreleri belirlemek ve αSMA-pozitif hücrelerin sayısallaştırılması için FACS analizi. F. QPCR tarafından saptanır fibrotik belirteçler ve sitokinler. TNBS ile tedavi edilen ve kontrol edilen farelerin kolon lysate αSMA batı leke analizi. Bu değiştirilmiş rakam Mukozal İmmünoloji önceki yayın9 izni ile yeniden kullanılıyor, 2019 Mathur ve ark. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: TNBS Fibrozis Crohn ilişkili Intestinal fibrozis ile karşılaştırılabilir. A. Kontrol kolon biyopsilerinin temsili görüntüleri, submukozal tabakalarda trikrom mavi boyama ve αSMA-pozitif boyamada önemli bir artış gösteren aktif CD, ölçek çubuğu 50 μm. B. ΑSMA ekspresyonu ve nicelleştirmenin batı leke analizi. Fibrotik belirteçler ve sitokinlerin C. qPCR analizi. Bu değiştirilmiş rakam Mukozal İmmünoloji önceki yayın9 izni ile yeniden kullanılıyor, 2019 Mathur ve ark. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Rapamisin tedavisi TNBS kaynaklı fibrozisi etkili bir şekilde iyileştirir. A. Kolon histolojik analizi – Trikrom mavisi anti-αSMA antikor ve kollajen boyama ile miyofibroblast boyama temsili görüntüler, ölçek çubuğu 100 μm. ΑSMA b. qPCR analizi, Kollajen ve TGFβ ekspresyonu Kontrol/ TNBS ile işlenmiş fare kolonu. C. Kontrol/TNBS ile tedavi edilen fare kolonundan tek hücreli süspansiyonda αSMA’nın FACS analizi. D. Kolonlamina propria fraksiyonundan Cx3Cr1+ hücrelerin saflaştırılması ve saflaştırılmış hücrelerin FACS analizi için şematik. E. TNBS ve/veya rapamisin ile tedavi edilen farelerden saflaştırılmış Cx3Cr1+ mononükleer fagositlerde p-p70 ve p-S6 düzeylerinin batıda leke analizi. IL-23 ve IL-1β üreten saflaştırılmış Cx3Cr1+ mononükleer fagositlerde ifadenin F. qPCR analizi. Bu değiştirilmiş rakam Mukozal İmmünoloji önceki yayın9 izni ile yeniden kullanılıyor, 2019 Mathur ve ark. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Yara iyileşmesi veya doku onarımı sıkı bir şekilde düzenlenmiş biyolojik bir süreçtir17. Kimyasal, mekanik ve enfeksiyon durumu ile doku yaralanması sırasında, inflamatuar bir yanıt doku onarım sürecini tetikler. Ancak, bir disregulated ve patolojik inflamatuar yanıt yara veya fibrotik reaksiyon gelişmekte olan doku onarım fonksiyonu bozabilir yol açar9,18,19. Burada, insan Crohn hastalığı ile patofizyolojisi önemli ölçüde paylaşan TNBS kaynaklı fibrozis hayvan modeli için prosedür göstermektedir. Fare epiteline zarar vermek için TNBS kimyasal maruziyetinin art arda aşılanması derin ülserasyonlara neden olur ve fibrozis gelişimine neden olur. Güvenilir, düşük maliyetli ve hastalığın hızlı indüksiyonu ile bu yöntem doku hasarı, transmural inflamasyon ve bağırsak-beyin ekseni için çalışmalarda yer alan birden fazla araştırma grubu tarafından yaygın olarak kabul edilir.
TNBS fibrozis modelini başarıyla uygulamak için birkaç temel adım vardır. Örneğin, yeterli dozaj ve TNBS uygulama zamanlaması çok önemlidir. 6-8 haftalık TNBS aşısı derin doku ülserasyonuna izin verir ve kronik fibrotik çalışmalar için şiddetle tavsiye edilir. Farelerden gelen dışkı ve aşılanmış TNBS retrograd refleks farelere değişken dozlarda teslim neden olabilir iki önemli sorunlar vardır. Fare rektumuna yakın hafif basınç, TNBS uygulamasından önce dışkının serbest bırakılmasına yardımcı olabilir. Hayvanın başını birkaç saniye aşağıda tutmak, TNBS’nin reflüsünün tersine dönemesini önemli ölçüde engellemeye yardımcı olur. Fareleri bir kafeste tutmak, kafesi Bir ısı yastığına yerleştirmek ve farelere Napa nektar sağlamak da yüksek mortaliteyi önlemede yararlı stratejiler olabilir.
Burada, biz de TNBS fibrozis sırasında bağırsak iltihabı ve fibrotik yanıt üzerindeki etkileri tartışmak. mTOR/otofaji rolü geniş ölçüde intestinal homeostaz ve IBD patogenezinde20,21. MTOR/otofaji sinyalizasyonunun, Pro-fibrotik IL-23/IL-22 eksenini etkileyen Cx3Cr1+ mononükleer fagositlerden IL-23 ve IL1β sitokinlerden pro-inflamatuar yanıtları modüle etmek için kritik olduğunu tespit ettik (Şekil 3A)9 . Böylece immünprofiling ve gen ekspresyonu için tek Cx3Cr1+ mononükleer hücrelerin arındırılması modelin kritik bir adımıdır. Lamina propria’yı izole etme protokolünü ayrıntılı olarak tartışıyoruz ve manyetik boncuklar kullanarak Cx3Cr1+ mononükleer hücreler için arıtma prosedürünü sağlıyoruz.
Topluca, Crohn hastalığı için genetik ve spontan modellerin varlığına rağmen, TNBS-kolit CD immünopatogenezini incelemek için güçlü bir araç olmaya devam etmektedir ve Crohn fibrozis tedavilerini değerlendirme potansiyeline sahiptir. TNBS gibi kimyasal kaynaklı fibrozis modellerinin kullanılmasının en önemli sınırlaması, kullanıcıdan kullanıcıya yüksek değişkenlik şansı ve verilerdeki aykırılık olasılığıdır. Daha fazla kullanıcı deneyimi ile birlikte grup başına 5-8 hayvan bir örnek boyutu modelin tutarlılığını artırabilir. Ancak, spontan Crohn fibrozis neden uygun bir genetik model bulma ve her zaman garanti edilecektir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibe R01NS093045 (Y.H.), NIH hibe K08DK088950 (X.Z.), R03DK09956 (X.Z.) ve Crohn’s & Colitis Foundation of America araştırma Bursu (CCFA) 481637 (R.M.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4 | e-bioscience | 53-9760-82 | |
| Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77 | e-bioscience | 149760-80 | |
| Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70 | Biolegend Inc | 101226 | |
| Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11 | Biolegend | 149006 | |
| Anti-mouse purified CD16/32 Fc block | Biolegend Inc | 14-9760-80 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-105-639 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | e-bioscience | 7074 | |
| Bovine Serum Albumin | InvivoGen | tlrl-isdn | |
| Collagenase type IV | Roche | 1088866001 | |
| DAPI | SIGMA | D9542 | |
| DMEM | Corning | 10013-CV | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | D263-5vl | |
| Falcon® 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit | BD Bioscience | 555028 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | www.flowjo.com | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | e-bioscience | 5018 | |
| Graphpad Prism 7 | GraphPad Software Inc | www.graphpad.com | |
| H&E kit | American Mastertech Kit | HXMMHPT | |
| Image J | NIH | www.imagej.nih.gov/ij/ | |
| Mouse: C57BL/6J | Jackson Laboratories | 664 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Percol | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| PMA/Ionomycin salt | Sigma | P8139 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermofisher | A25777 | |
| Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11 | Cell signaling | 5174 | |
| Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7 | Cell signaling | 2708 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371 | Cell signaling | 9208 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E | Cell signaling | 4858 | |
| Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein | Cell signaling | 2217 | |
| Rapamycin | LC LABORATORIES | 1003799 | |
| TNBS | Sigma | 92823 | |
| Trichorme staining kit | American Mastertech Kit | STOSTBPT | |
| TRIzol | Life technologies | 15596018 | |
| Verso cDNA Synthesis Kit | Thermofisher | AB1453B | |
| Zen black 2.1 | Carl Zeiss | www.zeis.com | |
| Zen blue lite 2.3 | Carl Zeiss | www.zeis.com |
References
- Garrett, W. S., Gordon, J. I., Glimcher, L. H. Homeostasis and inflammation in the intestine. Cell. 140, 859-870 (2010).
- Park, S. G., et al. T regulatory cells maintain intestinal homeostasis by suppressing gammadelta T cells. Immunity. 33, 791-803 (2010).
- Speca, S., Giusti, I., Rieder, F., Latella, G. Cellular and molecular mechanisms of intestinal fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18, 3635-3661 (2012).
- Keubler, L. M., Buettner, M., Hager, C., Bleich, A. A Multihit Model: Colitis Lessons from the Interleukin-10-deficient Mouse. Inflammatory Bowel Disease. 21, 1967-1975 (2015).
- Strober, W., Nakamura, K., Kitani, A. The SAMP1/Yit mouse: another step closer to modeling human inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 107, 667-670 (2001).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology-Gastroenterology and Liver Physiology. 296, G135-G146 (2009).
- Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery. 11, 9-15 (2016).
- Loeuillard, E., et al. 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced chronic colitis with fibrosis and modulation of TGF-beta1 signaling. World Journal of Gastroenterology. 20, 18207-18215 (2014).
- Mathur, R., et al. Induction of autophagy in Cx3cr1(+) mononuclear cells limits IL-23/IL-22 axis-mediated intestinal fibrosis. Mucosal Immunology. 12, 612-623 (2019).
- Joeris, T., Muller-Luda, K., Agace, W. W., Mowat, A. M. Diversity and functions of intestinal mononuclear phagocytes. Mucosal Immunology. 10, 845-864 (2017).
- Mathur, R., et al. A mouse model of Salmonella typhi infection. Cell. 151, 590-602 (2012).
- Zhao, X., et al. Noninflammatory Changes of Microglia Are Sufficient to Cause Epilepsy. Cell Reports. 22, 2080-2093 (2018).
- Murugaiyan, G., et al. MicroRNA-21 promotes Th17 differentiation and mediates experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 125, 1069-1080 (2015).
- Hinz, B., Celetta, G., Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Chaponnier, C. Alpha-smooth muscle actin expression upregulates fibroblast contractile activity. Molecular Biology of the Cell. 12, 2730-2741 (2001).
- Yang, J., et al. Rapamycin Inhibition of mTOR Reduces Levels of the Na+/H+ Exchanger 3 in Intestines of Mice and Humans, Leading to Diarrhea. Gastroenterology. 149, 151-162 (2015).
- Mutalib, M., et al. The use of sirolimus (rapamycin) in the management of refractory inflammatory bowel disease in children. Journal of Crohns and Colitis. 8, 1730-1734 (2014).
- Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair at a glance. Journal of Cell Science. 122, 3209-3213 (2009).
- Paul, J., et al. IL-17-driven intestinal fibrosis is inhibited by Itch-mediated ubiquitination of HIC-5. Mucosal Immunology. 11, 427-436 (2018).
- Sohail, I., Ghosh, S., Mukundan, S., Zelewski, S., Khan, M. N. Role of Inflammatory Risk Factors in the Pathogenesis of Streptococcus pneumoniae. Frontiers of Immunology. 9, 2275 (2018).
- Laplante, M., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth control and disease. Cell. 149, 274-293 (2012).
- Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448, 427-434 (2007).
Cite This Article
Mathur, R., Alam, M. M., Zhao, X., Huang, Y., Zhu, X. Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin. J. Vis. Exp. (151), e60067, doi:10.3791/60067 (2019).