Mechanistische Einblicke in die Entwicklung von TNBS-vermittelter Darmfibrose und Bewertung der hemmenden Wirkungen von Rapamycin
1Department of Molecular and Cellular Physiology,Albany Medical College, 2The IBD Center, Division of Gastroenterology, Department of Medicine,Albany Medical College, 3Department of Geriatrics, School of Medicine and Health Science,University of North Dakota, 4Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics,Albany Medical College
Summary
In dieser Studie beschreiben wir ein detailliertes Verfahren der TNBS-vermittelten Darmfibrose, die eine vergleichbare Pathophysiologie wie Morbus Crohns Fibrose aufweist. Wir diskutieren diesen Ansatz auch im Lichte von Rapamycin erleichterthemmende Auswirkungen auf Darmfibrose.
Abstract
Bedeutende Studien wurden durchgeführt, um ein effektives Management von Darmfibrose zu verstehen. Jedoch, der Mangel an besseren Kenntnissen über Fibrose hat die Entwicklung eines präventiven Medikaments behindert. In erster Linie ist es eine Herausforderung, ein geeignetes Tiermodell zu finden, um den Mechanismus der Crohn-assoziierten Darmfibrosepathologie zu verstehen. Hier haben wir eine effektive Methode eingeführt, bei der die chemische Exposition von TNBS bei Mäusen rektums im Wesentlichen tiefe Geschwüre und chronische Entzündungen hervorruft und die Mäuse dann chronisch Darmfibrose entwickeln. Außerdem beschreiben wir eine Technik, bei der eine Rapamycin-Injektion hemmende Wirkungen auf TNBS-vermittelte Fibrose im Mausmodell zeigt. Um den zugrunde liegenden Mechanismus der Fibrose zu bewerten, diskutieren wir methodisch ein Verfahren zur Reinigung von Cx3Cr1+-Zellen aus der Laminapropria von TNBS-behandelten und kontrollierbaren Mäusen. Dieses detaillierte Protokoll wird für Forscher hilfreich sein, die den Mechanismus der Fibrose untersuchen und den Weg ebnen, um eine bessere therapeutische Erfindung für Morbus Crohns assoziierte Darmfibrose zu finden.
Introduction
Dysregulation der Immunhomöostase im Darm führt zu pathogenen Entzündungen und ist weithin bekannt, entzündliche Darmerkrankung (IBD)verursachen 1,2. Darmfibrose ist eine chronische Folge von entzündlichen Darmerkrankungen (IBDs), wie Morbus Crohn (CD)3. Die irreversible Pathophysiologie der CD umfasst Darmstrenge oder Stenose der Fibrose, die Behandlungsmöglichkeiten begrenzt, und ohne Medikamente derzeit verfügbar, ist die einzige Behandlung die Operation. Letztlich ist die Entwicklung wirksamer Therapien zur Bekämpfung unangemessener Entzündungen dringend notwendig, um den Mechanismus von CD zu untersuchen, und dies wird uns einen Schritt näher führen.
Eine Vielzahl von genetischen Mausmodellen zur Untersuchung von IBD einschließlich IL10 KO, SAMP/Yit und Adoptiv-CD45+RB-Hochzellübertragung in SCID-Mäuse4,5,6. Hier zeigen wir das Verfahren zur TNBS-vermittelten Fibrose im Mausmodell von CD, das mit der Pathologie der menschlichen Crohn-Fibrose vergleichbar ist. Das TNBS-induzierte Modell hat gewisse Vorteile. Dieses Modell ist technisch einfach; Krankheitsbeginn ist schnell, kostengünstig und könnte häufig bei verschiedenen Tieren (z. B. Maus, Ratte und Meerschweinchen7) verwendet werden. Die gleichzeitige Anwendung von Ethanol und TNBS (2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure) schädigt abrupt die Darmbarriere und setzt Darmgewebeprotein TNBS aus und löst erhebliche immunologische Reaktionenaus 8,9. Die wiederholte Exposition von TNBS führt zu einem überreaktiven Reparaturprozess, der auf Entzündungen und Verletzungen reagiert, und entwickelt eine fibrotische Reaktion im Darm. Somit dient das TNBS-induzierte Fibrosemodell dazu, ein sehr überzeugendes Modell zur Untersuchung der von Crohn assoziierten Darmfibrose zu sein.
Darüber hinaus sind mononukleäre Phagozyten die Primärzellen, die die angeborene Immunantwort auf Pathogenese und Verletzungen im Darm10,11,12,13vermitteln. Um den zellulären Mechanismus aufzuklären und die Rolle von Cx3Cr1+ mononukleären Phagozyten im TNBS-Fibrosemodell zu etablieren, zeigen wir das Verfahren zur Reinigung der mononukleären Phagozyten. Die Analyse von Cx3Cr1+ Zellen ist ein wesentlicher Schritt, um die Entzündungsmarker zu bewerten und den Begleitmechanismus für Darmfibrose zu bestimmen. Zusammen genommen wird dieses detaillierte Verfahren für TNBS-Fibrose hilfreich sein, um die zellulären Mechanismen der Darmfibrose zu erklären.
Protocol
Für dieses Manuskript wurden alle menschlichen Proben nach dem genehmigten Protokoll des Institute Review Board (IRB) und des Committee on Human Research am Albany Medical College beschafft. Alle Forschungen mit Tieren wurden streng nach dem genehmigten Protokoll des Institutional Animal Care and Use Committee am Albany Medical College sowie des National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals befolgt. . 1. Sammlung menschlicher Darmproben Sammeln Sie menschliche Gewebeproben gemäß den Protokollen des Forschungsausschusses der Institution. Beschaffen Sie Darmgewebe (ileokolonisch) eines CD-Patienten mit Fibrose diagnostiziert und Kontrollproben von Patienten ohne Vorgeschichte von IBDs. Verwenden Sie einen Teil des Darmgewebes für die Immunhistologie, einen weiteren Teil des Gewebes zur Analyse von mRNA und einen letzten Teil für die Proteinexpression von fibrotischen und Zytokingen/Markern. Für die Immunhistologie-Analyse, fixieren Sie zuerst die menschliche Gewebeprobe in 4% Paraformaldehyd für mindestens 48 h und übertragen Sie sie dann in ein Rohr mit 70% Ethanol für mindestens 16 h. Verwenden Sie dieses feste Gewebe für die Herstellung eines paraffin-eingebetteten Blocks und schneiden Sie 5 m dickes Gewebe mit einem Gewebemikrotom. Mit einem Pinsel, verteilen Sie vorsichtig jeden Schnittabschnitt auf einem Glasschlitten für die Färbung. Fleckengewebe-Sektionsschlitten mit trichromem Fleck, um kollagenablagerungen zu erkennen, und mit SMA-Färbung, um Myofibroblasten zu erkennen (siehe Abschnitt 3 für detaillierte Informationen über Trichrom- und SMA-Färbung). Untersuchen Sie die gebeizten Abschnitte unter einem Lichtmikroskop. Verarbeiten Sie einen weiteren Teil der erhaltenen menschlichen Gewebeprobe, um Proteinlysat herzustellen, um SMA über Western Blot zu detektieren (siehe Abschnitt 7 für detaillierte Informationen über die Western Blot-Analyse). Erhalten Sie RNA aus dem letzten Teil der menschlichen Gewebeprobe mit einem Extraktionsreagenz (Materialtabelle) und wandeln Sie mRNA über RT-PCR in cDNA um. Analysieren Sie fibrotische und Zytokingene nach qPCR (siehe Abschnitt 6 für detaillierte Informationen zur mRNA-Vorbereitung). 2. Induktion von TNBS-Fibrose und Rapamycin-Behandlung bei Mäusen Durchführung von Tierforschung gemäß den von der Institution genehmigten Tierforschungsprotokollen. Rasieren Sie erwachsene Mäuse um den Halsbereich, um TNBS durch dermale Exposition vorzusensitieren. TNBS in einem Wattestäbchen einweichen und dann TNBS auf den rasierten Bereich des Maushalses auftragen.HINWEIS: Die Vorsensibilisierung ist ein sehr wichtiger Schritt, da sie die verzögerte Reaktion auf Überempfindlichkeit verbessert, um eine TNBS-vermittelte Entzündung zu initiieren. Acht Tage nach der Präsensibilisierung, induzieren Colitis durch intrarektale Verabreichung einmal pro Woche für sechs Wochen. Tragen Sie vier mg TNBS (in 25 % Ethanol) mit einem 100 l Einlauf über eine 1 ml Spritze auf, die an einem 3,5 französischen Polyurethankatheter befestigt ist, und geben Sie Kontrollmäusen 100 l nur 25 % Ethanol. Anästhesisieren Sie Mäuse mit Pentobarbital (25 mg/kg intraperitoneal) oder setzen Sie sie 2,5% Isofluran zusammen mit 1 L/min Sauerstoff während der TNBS-Verabreichung aus. Bestätigen Sie die Anästhesisierung, indem Sie sanft zehenkneifen und nach einem Reflex fehlen. Verwenden Sie die tierärztliche Salbe an den Augen, um Trockenheit zu verhindern, während Mäuse unter Anästhesie sind. Injizieren Sie Rapamycin mit 2 mg/kg/Tag oder Fahrzeug (5% Tween-20 und 4% Ethanol) jeden Wochentag für 3-6 Wochen, intraperitoneal, sowohl an Kontroll- als auch an TNBS-behandelten Mäusen. Verwenden Sie 6-wöchigen TNBS postbehandelten Mäusedarm für die Analyse der extrazellulären Assays einschließlich Histologie, Durchflusszytometrie, Western Blotting und RNA-Extraktion. Um Organe zu ernten, einschläfern Sie Mäuse mitCO2-Inhalation und bestätigen Sie Dieeuthanasie mit zervikaler Dislokation. Um Organe zu ernten, einschläfern Sie Mäuse mitCO2-Inhalation und bestätigen Sie Dieeuthanasie mit zervikaler Dislokation. Nach der Euthanasie öffnen Sie die Maus längs auf ihrer ventralen Seite mit chirurgischen Scheren und Zangen. Entfernen Sie den gesamten Doppelpunkt aus dem Rektum in den Terminal-Iliumbereich. Übertragen Sie den Doppelpunkt schnell auf eiskalte 1x HBSS und waschen Sie den Doppelpunkt mit dem gleichen Puffer. Messen und vergleichen Sie die Doppelpunktlängen der kontrollierbaren und tNBS-behandelten Mäuse. Führen Sie diesen Schritt so schnell wie möglich aus, um das Austrocknen der Dickdarmdoppeltzufälle zu vermeiden, um Zellsterben zu vermeiden. Den Dickdarm in kleine Stücke schneiden und bei -80 °C für die Lagerung für zukünftige Zwecke aufbewahren (RNA/Western Blot Analysis). Verwenden Sie ein anderes Stück des Doppelpunkts für die FACS-Analyse. Achten Sie darauf, Zuschneiden und sammeln Kolongewebe Proben aus ähnlichen Regionen des Dickdarms von Kontroll- und TNBS-behandelten Tieren.HINWEIS: Es wird eine Sterblichkeit von 10%-20% mit TNBS-Impfung erwartet, obwohl die Sterblichkeitsrate mit Erfahrung signifikant gesenkt werden kann. 3. Immunhistopathologische Beurteilung der Darmfibrose Beheben Sie menschliches und/oder Mäusegewebe in 4% Paraformaldehyd für 48 h, und übertragen Sie dann auf 70% Ethanol für 16 h.HINWEIS: Paraformaldehyd ist eine neurotoxische Chemikalie, also vermeiden Sie das Einatmen; verwenden Sie eine Gesichtsmaske, während Sie sie verwenden. Paraffin bettet die festen Dickdarmgewebe ein, schneidet auf eine Dicke von 5 m und legt das Gewebe direkt auf Glasgrollen für die Histologie. Führen Sie H&E- und Trichrome Blue-Färbung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch, um Kollagen zu erkennen. Kurz gesagt, zuerst deparaffinisieren Abschnitte durch Untertauchen der Folie mit Abschnitten in zwei Kammern von Xylol für 5 min in jeder Kammer. Spülen Sie Rutschen mit 100% Alkohol für 1 min; Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. 1 min mit Leitungswasser wieder abspülen. Danach gleitet eintauchen in vorgewärmte Bouin-Lösung bei 56 °C für 60 min. Bouins Lösung ist gelb im Aussehen; Waschen Sie nach dem Herausnehmen der Dias aus Bouins Lösung in Leitungswasser für 3 min oder bis Dias farblos wurden. Tauchen Sie in Modified Mayer s Hematoxylin Lösung für 7 min bei Raumtemperatur. Stain gleitet durch Eintauchen in Trichrome Fleck für 5-8 min. Sofort, spülen Sie diagleitet in fließendem Wasser für 5-10 s, um überschüssige Trichrome Fleck zu entfernen. Dehydrieren Sie Dias mit 100% Alkohol für 1 min. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal. Löschen Sie Dias mit Xylol für 1 min und wiederholen Sie den Schritt 3x. Montagevon Dias mit Montagemedien (Materialtabelle). Halten Sie den Coverslip vorsichtig an einem Ende mit Zangen und lassen Sie es den gesamten Abschnitt abdecken, ohne Blasen zu haben. Wenn es einige Blasen gibt, entfernen Sie schnell Blasen, indem Sie auf den Deckelzettel tippen. Verwenden Sie Die Immunostainierung, um die SMA zu erkennen. Block-Doppelpunktabschnitte im Sperrpuffer (0,2% Triton X-100 und 5% normales Ziegenserum in 1x PBS) für 1 h bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie mit 100 l verdünntem Primärantikörper für die SMA (Materialtabelle) auf der Dialösung (0,2% Triton X-100 und 3% normales Ziegenserum in 1x PBS; Anti-SMA 1:200) bei 4 °C über Nacht. Waschen Sie die Abschnitte dreimal mit 1x PBS. Verwenden Sie Ziegen-Anti-Maus-IgG (H + L) konjugiert mit Alexa Fluor 488 (Materialtabelle) als sekundären Antikörper für 2 h bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Abschnitte dreimal mit 1x PBS. Verwenden Sie DAPI, um den Kern für 5 min zu verfärben. Waschen Sie die Abschnitte dreimal mit 1x PBS. Montieren Sie Dias mit fluoreszierenden Montagemedien (Tisch aus Materialien) und versiegeln Sie mit einem Deckelschlupf mit Nagellack. Erfassen Sie Bilder mit dem konfokalen Mikroskop LSM 880 und verarbeiten Sie Bilder mit Mikroskopsoftware. Quantifizieren Sie Bilder, indem Sie mit ImageJ durchschnittlich mehrere ausgewählte Bereiche im gleichen Abschnitt einnehmen. 4. Isolierung der Darmlamina propria und Reinigung von Cx3Cr1+ mononukleären Phagozyten Längs öffnen Sie den Dickdarm in eiskaltem Hank es Balanced Salt Solution (HBSS; Materialtabelle) und waschen Sie den Doppelpunkt mit dem gleichen Puffer. Schneiden Sie ca. 5 cm kleine Stücke dicker Gewebe mit steriler Schere in HBSS. Kleine Dickdarmgewebestücke in ein 50 ml konisches Rohr mit 10 ml Vorverdauungspuffer (1x HBSS mit 5% FBS, 5 mM EDTA und 1 mM DTT) übertragen und 20 min bei 100 U/min in einem 37 °C Inkubatorschütteln 11.HINWEIS: Die Inkubation von Kolongewebe in 37 °C bei 100 Rpm Schüttelungszustand ermöglicht eine effiziente Kollagenase-Gewebeverdauung und eine hohe Ausbeute an lebensfähigen Zellen. Entsorgen Sie das abgetrennte Kolonepithel, indem Sie ein 40-m-Zellsieb durchlaufen. Sammeln Sie das restliche Gewebe vom Sieb und verdauen Sie es im Verdauungspuffer mit Kollagennase Typ IV und DNase I (Materialtabelle) in 1x HBSS mit 5% FBS für 20 min bei 37 °C bei 100 Rpm. Wirbeln Sie das verdaute Gewebe für ca. 20 s und passieren Sie ein 40 m Zellsieb, um Lamina-Propria-Fraktionen zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Lamina-Propria-Fraktionen, um die Zellen bei 700 x g bei 4 °C zu zerpelln Um abgestorbene Zellen aus der Lamina propria auszuschließen, verwenden Sie einen Dichtegradienten (Materialtabelle).ANMERKUNG: Die hier verwendeten Dichtegradientenmedien (Materialtabelle) können zum Verlust mononukleanischer Zellen führen; jedoch entfernt es abgestorbene Zellen stark aus dem Präparat, was insgesamt die Reinheit erhöht. Machen Sie jeweils 100 ml mit 30 % und 70 % Dichtegradienten-Medienlösungen. Setzen Sie die erhaltenen Zellen in 10 ml der 30%-Lösung wieder auf und überlagern Sie auf 5 ml der 70%-Lösung in einem 15 ml-Rohr. Zentrifugieren Sie den Gefälle in einem bremsfreien Zustand bei 1.000 x g und Raumtemperatur. Sammeln Sie die weiße Ringphase mit Lamina propria Lymphozyten, die zwischen den 30% und 70% Gradientenschichten liegen wird. Waschen Sie die erhaltenen Zellen durch Erneutaushängen in eiskaltem HBSS und Zentrifuge bei 500 x g, 20 °C, für 10 min. Resuspendzellen im FACS-Puffer (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung) (PBS, pH 7,4, mit 1% BSA und 2 mM EDTA). Reinigen Sie mononukleäre Phagozyten aus der gesammelten Zellreinigung mit magnetischen Perlen und/oder FACS-Sortierung. Magnetische Reinigung Vor der Färbung mit Antikörpern, erste Block Zelloberfläche von Lamina Propria Zellen durch Inkubation mit Anti-Maus CD16/CD32 Fc Blocker für 15 min auf Eis. Inkubieren Sie Zellen mit Anti-Cx3Cr1-PE (Phycoerythrin) Antikörper zusammen mit Anti-PE-Mikroperlen (Tabelle der Materialien) für 30 min auf Eis, um die gebundenen Zellen zu erfassen. Waschen Sie Zellen mit FACS-Puffer. Übergeben Sie die Antikörper-/Perlengebundenen Zellen durch eine magnetisch aktivierte Zellsortierspalte in einem Magnetfeld, um ungebundene Zellen zu entfernen. Dreimal mit FACS-Puffer waschen. Entfernen Sie die Säule aus dem Magnetfeld und drücken Sie den Kolben in der Spalte, um perlengebundene Zellen zu erhalten. FACs-SortierungHINWEIS: Die FACS-Sortierung kann anstelle der magnetischen Reinigung verwendet werden. Obwohl die magnetische Reinigung eine einfache und kostengünstige Methode ist, beschränkt sie sich auf die Reinigung einzelner Zellen, nicht auf Subpopulationen von Zellen. Daher ist die FACS-Sortiermethode eine effektive Methode zum Sortieren einzelner Zellen sowie von Subpopulationen von Zellen, um Subpopulationen von Zellen zu isolieren. Block lamina propria zellen mit Anti-Maus CD16/CD32 Fc Blocker (Tisch der Materialien). Stain Zellen durch Inkubation mit Anti-CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C und MHCII Antikörper. Sortieren Sie mit einem FACS-Durchflusszytometer, Gating für CD11c-CD64+ CD11b+ Cx3Cr1+ Ly6C- Zellen, um die CX3Cr1 (P3 + P4) Population zu reinigen. Lyse-sortierte Zellen zur gesamten RNA-Vorbereitung und Nachweis von Zytokin- und Fibrotischen Markern (siehe Abschnitt 6 für die RNA- und cDNA-Präparation). Analysieren Sie die mRNA-Expression von fibrotischen Markern und die entzündliche Zytokinanalyse aus isolierten einzelzelligen Suspensionen aus der magnetischen Reinigung. Für die FACS-Analyse blockieren Zellen mit Anti-Maus-CD16/CD32-Fc-Blocker (Materialtabelle) vor der Färbung mit Antikörpern gegen Oberflächen- oder intrazelluläre Marker. 5. Durchflusszytometrie-Analyse Zelloberflächenfärbung und -analyse 5-10 x 105 isolierte Lamina-Propria-Zellen in 50 ml FACS-Puffer (1% BSA, 2 mM EDTA in PBS, pH 7,4) resuspendieren. Inkubieren Sie Zellen mit Anti-Maus-CD16/CD32 (Materialtabelle) bei einer Verdünnung von 1:50, um Fc-Rezeptoren auf Eis für 10 min zu blockieren. Waschen Sie Zellen mit 500 l eiskalten FACS-Puffer, um ungebundene Anti-CD16/CD32 vor der Zelloberflächenfärbung zu entfernen. Oberflächenfleckkolonische einzelzellige Suspensionen (106 Zellen/50 ml) mit fluoreszierend markiertem Antikörper bei 1:100 Verdünnung auf Eis für 30 min zur Beurteilung der kolonischen Laminapropria. Waschen Sie beschriftete Zellen zweimal mit 500 l eiskalten FACS-Puffer, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Analysieren Sie beschriftete mononukleäre Zellen durch Durchflusszytometrie. Gate for Live, dann für FSC+SSC+ gefolgt von CD11b+ Cx3Cr1+, und dann andere Makrophagen-Aktivierungsmarker wie MHCII, CD80, CD86 und CD40 analysieren. Intrazelluläre Zytokinfärbung und -analyse Für intrazelluläre Zytokinfärbung, fixieren und permeabilisieren Sie die oberflächenbefleckten Zellen mit einem Fixation/Permeabilization Solution Kit (Tabelle der Materialien); Bitte befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für detaillierte Schritte. Gate Lamina Propria Zellen für Live, dann für FSC+SSC+ gefolgt von CD11b+ Cx3Cr1+IL23+ zum Nachweis des intrazellulären Niveaus von IL23 Zytokin und CD11b+ Cx3Cr1+IL1 intrazellulären Gehalt an IL1-Zytokin zu erkennen. • SMA Färbung und Analyse Waschen Sie Zellen mit FACS-Puffer zweimal durch Zentrifugieren bei 200 x g und 4 °C für 5 min, um überschüssigen fixativen Puffer zu entfernen. Um die SMA-Ebene zu bestimmen, permeabilisieren Sie Zellen mit einem Fixation/Permeabilization Solution Kit (Tabelle der Materialien). Inkubieren Sie Zellen mit Anti-SMA-AF488-Antikörper (Materialtabelle) mit 1:1.000 Verdünnung auf Eis für 30 min. Waschen Sie Zellen zweimal und machen Sie dann FACS-Analyse. Gate for Live, FSC+SSC+ gefolgt von der Detektion von SMA+ Zellen in Kolonzellen. 6. RNA-Isolation, RT-PCR, Echtzeit-PCR Isolieren Sie RNA aus MACS oder FACS gereinigten Zellen oder Dickdarm ausgeschnittenes Gewebe durch Homogenisierung in Extraktionsreagenz (Materialtabelle).HINWEIS: Verwenden Sie Sicherheitsbrillen und andere Laborschutzausrüstung, wenn Sie mit diesem Reagenz arbeiten, da es eine Lungen- und Hautreizung ist. Arbeiten Sie sicher in einer Haube. Fügen Sie 0,5 l RNase-freies Glykogen aus 20 g/ml Glykogen-Stammlösung(Tabelle der Materialien) hinzu, um die Rückgewinnung der gesamten RNA vor dem Ausfallen der RNA mit Isopropanol zu verbessern. Setzen Sie das RNA-Pellet in 50 l RNase-freies Wasser(Materialtabelle)wieder auf und inkubieren Sie bei 55 °C für 5 min, um den RNA-Gaumen vollständig aufzulösen. Lesen Sie die RNA-Konzentrationen mit einem Spektralphotometer bei 260 nm. Synthetisieren Sie cDNA mit 1 g Gesamt-RNA und einem Reverse-Transkriptionssynthese-Kit (Tabelle der Materialien). Analysieren Sie die Genexpression mit 2 L cDNA als Vorlagen über Echtzeit-PCR. Verwenden Sie eine 96-Well PCR Platte qPCR Master Mix Kit (Tabelle der Materialien). Verwenden Sie CT-Werte, um die Faltänderung der RNA-Überfluss nach der Normalisierung der GAPDH/HPRT-Werte zu berechnen. 7. Western Blotting Lyse-Kolongewebe mit RIPA-Lysepuffer (1% NP40). Proteinlysat in einem 8% Bis-Tris-Gel bei einer konstanten Spannung von 80 V auflösen. Übertragen Sie Gelprotein auf Nitrocellulose-Membranen im Kalttransferpuffer mit einem konstanten Strom von 50 mA für 2 h bei 4 °C. Blockieren Sie unspezifische Regionen auf der proteinübertragenen Membran mit 5% fettfreier Milch in TBST (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1,5 M NaCl, 0,05% Tween-20) für mindestens 1 h bei Raumtemperatur. Um die SMA-Spiegel zu detektieren, inkubieren Sie Membranen mit dem primären Detektionsantikörper von SMA bei 4 °C über Nacht. Waschen Sie Membranen 3-4 mal mit TBST in 15 min Intervallen. Inkubieren Sie mit HRP-konjugiertem Sekundärantikörper (1:10.000) in 5% fettfreier Milch in TBST. Entwickeln Sie Membranen mit einem ECL-Entwicklungskit. Normalisieren Sie die Proteinsignalintensitäten mit GAPDH als Ladekontrolle für die Densitometrie-Analyse. 8. Statistische Analyse Analysieren Sie die Daten mithilfe einer Datenanalysesoftware der Wahl, indem Sie zwischen Wildtyp- und KO-Tieren vergleichen. Betrachten Sie den P-Wert von <0.05 als signifikant (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001). Verwenden Sie den t-Test von Student, um die Unterschiede zwischen zwei Gruppen und den ANOVA-Test für die Analyse zwischen mehr als zwei Gruppen zu testen.
Representative Results
Wir haben das TNBS Colitis Mouse Modell übernommen, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Darmfibrose zu untersuchen und aufzuklären8. Hier führten wir eine detaillierte Zeitkursstudie zur TNBS-vermittelten Kolitis durch, bei der TNBS wöchentlich bis zu sechs Wochen lang rekundig zu Wildtypmäusen verwaltet wurde, wie schematisch dargestellt (Abbildung 1A). Nach sechs Wochen TNBS-Behandlung stellten wir fest, dass sich die Kolonlängen im Laufe der TNBS-Behandlung schrittweise verkürzungn, von durchschnittlich 5 x 0,5 cm in der Kontrollgruppe auf 3 x 0,5 cm in der TNBS-Gruppe; eine solche quantitative Analyse der Doppelpunktlänge stellt eine sehr offensichtliche Verringerung der Doppelpunktlänge dar (Abbildung 1B). Um sicherzustellen, dass das Krankheitsmodell des TNBS Crohn mit dem Fibrosemodell des menschlichen Crohn vergleichbar ist und kein Artefakt im Zusammenhang mit der Methodik war, analysierten wir die fibrotischen Marker auf mehreren Ebenen in einer detaillierten Zeitkursstudie für die TNBS-Injektion in den Wildtyp. . Die Akkumulation von alpha-glatten Muskelaktin (SMA) positive Zellen und Kollagenablagerung innerhalb submukosaler Schichten wurden in den meisten Fibrose-Inzidenzen berichtet und gelten als Kennzeichen für fibrotische Ereignisse14. Wir fanden heraus, dass die Doppelpunktabschnitte von TNBS-behandelten Mäusen, die mit SMA gefärbt waren, eine 4-6-fache Zunahme der kolonischen Submukosa-Schicht zeigten, die positiv mit SMA gefärbt war (Abbildung 1C). Außerdem zeigte die Trichrome blaue Färbung für diese Abschnitte auch eine 2-4-fache Zunahme, was auf eine signifikante Kollagenablagerung hindeutet, die eine schwere Darmfibrose validiert (Abbildung 1D). Wir untersuchten weiter die Aktivierung von Myofibroblasten durch den Nachweis von SMA-positiven Zellen durch FACS-Analyse im TNBS-behandelten Mäusedarm und fanden eine signifikante Anhäufung von SMA-positiven Färbungen (Abbildung 1E). Darüber hinaus fanden wir eine substantielle Induktion in der Expression von SMA, Col-I und Col-III, gemessen durch qPCR-Analyse bei TNBS-behandelten Mäusen (Abbildung 1F). Erhöhte Expression des SMA-Proteins in der Western-Blot-Analyse ergab eine erhöhte Fibrose (Abbildung 1G). Insgesamt bietet die TNBS-Kinetik-Behandlung die Möglichkeit, auf eine vermeintliche Immunantwort bei chronischen Erkrankungen zuzugreifen, die die chronische Phase der CD genau nachahmt und für die Entwicklung der Fibrose unerlässlich ist. Um TNBS-Fibrose mit Morbus Crohns assoziierter Fibrose zu vergleichen, analysierten wir die Expression von Fibrosemarkern und Zytokinen in der Frischgewebebiopsie aus dem Ileum von Patienten mit aktiver CD oder unter Remission. Bemerkenswerterweise fanden wir eine deutliche Induktion der Verdickung von SMA-positiven Schichten und einer erhöhten Kollagenablagerung, wie sie durch Trichromfärbung in aktiven CD-Abschnitten nachgewiesen wurde (Abbildung 2A). Wir führten auch eine Western-Blot-Analyse durch und bestätigten die Induktion der SMA-Expression in aktiven CD-Samples (Abbildung 2B). Darüber hinaus beobachteten wir eine signifikante Induktion von Fibrosemarkern, einschließlich SMA, Col1, wie durch qPCR-Analyse nachgewiesen (Abbildung 2C). Als nächstes haben wir zur Bestimmung eines Mechanismus zur Begrenzung der TNBS-Fibrose die Wirkungen von Rapamycin, einem pharmakologischen Inhibitor der mTOR-Aktivität15,16, bewertet. Dementsprechend behandelten wir Mäuse mit TNBS und Rapamycin und analysierten den SMA- und Kollagenspiegel in der Darm-Histologie und haben eine quantitative Messung von SMA und Kollagen in der Densitometrie-Plot gezeigt (Abbildung 3A). Unsere Daten deuten darauf hin, dass Rapamycin die sMA-positive Färbung in submukosalen Schichten reduziert und die Kollagenablagerung verringert. Um die fibrotischen Reaktionen weiter zu validieren und zu quantifizieren, haben wir die Ausdrücke von SMA, Kollagen und TGF durch qPCR und die Durchflusszytometrie im TNBS-behandelten Doppelpunkt bestimmt (Abbildung 3B, 3C). Wir haben auch gezeigt, dass Cx3Cr1+ mononukleäre Phagozyten eine entzündliche Immunantwort auf Verletzungen9induzieren. So wollten wir sehen, ob die Verabreichung von Rapamycin bei TNBS-behandelten Mäusen die entzündlichen und fibrotischen Wirkungen umkehren kann. Daher reinigten wir Cx3Cr1+ ansässige mononukleäre Phagozyten aus kolonischen Einzelzellsuspensionen mit magnetischen Mikroperlen (Abbildung 3D). Wir fanden einen erhöhten Gehalt an p-p70 und p-S6 in Cx3Cr1+ ansässigen mononukleären Phagozyten durch Western-Blot-Analyse von TNBS-behandelten Mäusen, und dieser Pegel wurde durch Rapamycin blockiert (Abbildung 3E). Außerdem fanden wir heraus, dass die Behandlung von Rapamycin die IL-23 und IL-1 in der TNBS-behandelten Gruppe dämpft (Abbildung 3F). Darüber hinaus verdeutlichen diese Ergebnisse den wirksamen Mechanismus, der an der Induktion von TNBS-Fibrose beteiligt ist, und haben gezeigt, dass Rapamycin die Induktion von Fibrose dämmt. Abbildung 1: Erfolgreiche TNBS-Administration führt zur Entwicklung von Darmfibrose bei Mäusen. Eine. Schematische Darstellung der wöchentlichen TNBS-Behandlung von Wildtypmäusen. B. Kolonbilder und Messung der Dickdarmlängen von TNBS-behandelten Mäusen, geerntet in den Wochen 0, 2, 4 und 6 nach der TNSB-Behandlung. C-D. Die histologische Analyse von Kolonabschnitten, die mit Anti-SMA-Antikörpern zur Aktivierung von Myofibroblasten und trichromen blauen Färbungen für Kollagen gebeizt werden; Skala bar 100 ‘m. E. FACS-Analyse zur Identifizierung von SMA-positiven Zellen im Doppelpunkt und Quantifizierung von SMA-positiven Zellen. F. Fibrotische Marker und Zytokine, die von qPCR nachgewiesen wurden. G. Western-Blot-Analyse von SMA aus Doppellysat von TNBS-behandelten und Kontrollmäusen. Diese modifizierte Figur wird mit Genehmigung der vorherigen Publikation9 in Mucosal Immunology, 2019 von Mathur et al. wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: TNBS-Fibrose ist vergleichbar mit Morbus Crohn-assoziierter Darmfibrose. A. Repräsentative Bilder von Kolonbiopsien der Kontrolle, aktive CD, die eine signifikante Zunahme der trichromen blauen Färbung und der sMA-positiven Färbung in submukosalen Schichten zeigt, Skalenstab 50 m. B. Western Blot Analyse der SMA-Expression und Quantifizierung. C. qPCR-Analyse von fibrotischen Markern und Zytokinen. Diese modifizierte Figur wird mit Genehmigung der vorherigen Publikation9 in Mucosal Immunology, 2019 von Mathur et al. wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Die Rapamycin-Behandlung lindert tNBS-induzierte Fibrose effektiv. A. Darm histologische Analyse – repräsentative Bilder der Myofibroblastfärbung mit Anti-SMA-Antikörper und Kollagenfärbung mit Trichromblau, Maßstabsbalken 100 m. B. qPCR-Analyse von SMA-, Kollagen- und TGF-Expression in Control/ TNBS-behandelte Mausdoppelpunkte. C. FACS-Analyse von SMA in einzelzellige Suspension aus Maus-Doppelpunkt, der mit Control/TNBS behandelt wurde. D. Schematische Reinigung von Cx3Cr1+ Zellen aus kolonischer Laminapropriafraktion und FACS-Analyse gereinigter Zellen. E. Western Blot-Analyse der p-p70- und p-S6-Spiegel in gereinigten Cx3Cr1+ mononukleären Phagozyten von Mäusen, die mit TNBS und/oder Rapamycin behandelt wurden. F. qPCR-Analyse der Expression in gereinigten Cx3Cr1+ mononukleären Phagozyten, die IL-23 und IL-1- erzeugt. Diese modifizierte Figur wird mit Genehmigung der vorherigen Publikation9 in Mucosal Immunology, 2019 von Mathur et al. wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Wundheilung oder Gewebereparatur ist ein streng regulierter biologischer Prozess17. Bei Gewebeverletzungen mit einem chemischen, mechanischen und Infektionszustand löst eine Entzündliche Reaktion den Gewebereparaturprozess aus. Jedoch, eine dysregulierte und pathologische Entzündungsreaktion führt zur Entwicklung von Narbenbildung oder eine fibrotische Reaktion, die die Gewebereparaturfunktion beeinträchtigen könnte9,18,19. Hier zeigen wir das Verfahren für das TNBS-induzierte Fibrose-Tiermodell, das die Pathophysiologie signifikant mit der menschlichen Morbus Crohn teilt. Die sukzessive Impfung der chemischen TNBS-Exposition gegenüber Schäden am Mausepithel verursacht tiefe Geschwüre und induziert die Fibroseentwicklung. Mit einer zuverlässigen, kostengünstigen und schnellen Induktion von Krankheitsbeginn, wird diese Methode von mehreren Forschungsgruppen, die an Studien für Gewebeverletzungen, transmuraale Entzündungen und die Darm-Hirn-Achse beteiligt sind, weithin akzeptiert.
Um das TNBS-Fibrosemodell erfolgreich umzusetzen, gibt es mehrere wesentliche Schritte. Zum Beispiel, angemessene Dosierung und Timing der TNBS-Administration sind sehr wichtig. Eine 6-8-wöchige TNBS-Impfung ermöglicht tiefe Gewebeulzeration und wird dringend für chronische fibrotische Studien empfohlen. Der herauskommende Stuhl von Mäusen und der retrograde Reflex von geimpften TNBS sind zwei Große Probleme, die zur Abgabe variabler Dosen an Mäuse führen könnten. Sanfter Druck in der Nähe des Mäuserektums kann helfen, Hocker vor der TNBS-Verabreichung freizusetzen. Wenn man den Kopf des Tieres für ein paar Sekunden gedrückt hält, hilft dies, den rückkehrenden Rückfluss von TNBS zu stoppen. Die Mäuse in einem Käfig zu halten, den Käfig auf einem Wärmepolster zu platzieren und die Mäuse mit Napa-Nektar zu versorgen, könnte auch nützliche Strategien sein, um eine hohe Sterblichkeit zu verhindern.
Hier diskutieren wir auch die Darmentzündung während der TNBS-Fibrose und ihre Auswirkungen auf die fibrotische Reaktion. mTOR/Autophagie-Rolle ist weitgehend an der Darmhomöostase und an der IBD-Pathogenese20,21beteiligt. Wir haben festgestellt, dass mTOR/autophagy Signalisierung ist entscheidend, um pro-flamme Reaktionen von IL-23 und IL1″ Zytokine von Cx3Cr1+ mononukleären Phagozyten, die pro-fibrotische IL-23/IL-22 Achse beeinflussen modulieren (Abbildung 3A)9 . Dabei ist die Reinigung einzelner Cx3Cr1+ mononukleischer Zellen zur Immunprofilierung und Genexpression ein entscheidender Schritt des Modells. Wir diskutieren im Detail das Protokoll zur Isolierung von Lamina propria und bieten das Reinigungsverfahren für Cx3Cr1+ mononukleäre Zellen mit magnetischen Perlen an.
Zusammen genommen bleibt TNBS-Kolitis trotz des Vorhandenseins genetischer und spontaner Modelle für die Morbus Crohn ein wirksames Werkzeug, um die Immunpathogenese von CD zu untersuchen, und hat das Potenzial, die Fibrose-Behandlungen des Crohnzus zu bewerten. Die Hauptbeschränkung bei der Verwendung chemisch induzierter Fibrosemodelle wie TNBS ist die Chance auf eine hohe Variabilität von Benutzer zu Benutzer und die Möglichkeit von Ausreißern in den Daten. Eine Stichprobengröße von 5-8 Tieren pro Gruppe zusammen mit einer größeren Benutzererfahrung kann die Konsistenz des Modells erhöhen. Ein geeignetes genetisches Modell zu finden, das spontane Morbussis von Crohn verursacht, ist und bleibt jedoch gerechtfertigt.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das NIH-Stipendium R01NS093045 (Y.H.), das NIH-Stipendium K08DK088950 (X.Z.), R03DK099566 (X.Z.) und das Forschungsstipendium der Crohn es & Colitis Foundation of America (CCFA) 481637 (R.M.).
Materials
| Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4 | e-bioscience | 53-9760-82 | |
| Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77 | e-bioscience | 149760-80 | |
| Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70 | Biolegend Inc | 101226 | |
| Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11 | Biolegend | 149006 | |
| Anti-mouse purified CD16/32 Fc block | Biolegend Inc | 14-9760-80 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-105-639 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | e-bioscience | 7074 | |
| Bovine Serum Albumin | InvivoGen | tlrl-isdn | |
| Collagenase type IV | Roche | 1088866001 | |
| DAPI | SIGMA | D9542 | |
| DMEM | Corning | 10013-CV | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | D263-5vl | |
| Falcon® 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit | BD Bioscience | 555028 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | www.flowjo.com | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | e-bioscience | 5018 | |
| Graphpad Prism 7 | GraphPad Software Inc | www.graphpad.com | |
| H&E kit | American Mastertech Kit | HXMMHPT | |
| Image J | NIH | www.imagej.nih.gov/ij/ | |
| Mouse: C57BL/6J | Jackson Laboratories | 664 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Percol | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| PMA/Ionomycin salt | Sigma | P8139 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermofisher | A25777 | |
| Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11 | Cell signaling | 5174 | |
| Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7 | Cell signaling | 2708 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371 | Cell signaling | 9208 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E | Cell signaling | 4858 | |
| Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein | Cell signaling | 2217 | |
| Rapamycin | LC LABORATORIES | 1003799 | |
| TNBS | Sigma | 92823 | |
| Trichorme staining kit | American Mastertech Kit | STOSTBPT | |
| TRIzol | Life technologies | 15596018 | |
| Verso cDNA Synthesis Kit | Thermofisher | AB1453B | |
| Zen black 2.1 | Carl Zeiss | www.zeis.com | |
| Zen blue lite 2.3 | Carl Zeiss | www.zeis.com |
References
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Cite This Article
Mathur, R., Alam, M. M., Zhao, X., Huang, Y., Zhu, X. Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin. J. Vis. Exp. (151), e60067, doi:10.3791/60067 (2019).