Mechanistisch inzicht in de ontwikkeling van TNBS-gemedieerde intestinale fibrose en evaluatie van de remmende effecten van Rapamycine

Voor dit manuscript werden alle menselijke monsters aangekocht volgens het goedgekeurde Protocol van Institute Review Board (IRB) en door de Commissie onderzoek bij Albany Medical College. Alle onderzoek waarbij dieren werden betrokken, werd strikt gevolgd volgens het goedgekeurde protocol door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité bij het Albany Medical College en de National Institutes of Health Guide voor de verzorging en het gebruik van proefdieren . 1. verzameling van menselijke darm monsters Verzamel menselijke weefselmonsters volgens de protocollen van het onderzoekscomité van de instelling. Procure intestinale weefsel (ileocolonic) van een CD patiënt gediagnosticeerd met fibrose en controlemonsters van patiënten zonder geschiedenis van IBDs. Gebruik een deel van het darmweefsel voor immunohistologie, een ander deel van het weefsel voor het analyseren van mRNA, en een laatste deel voor eiwit expressie van fibrotische en cytokine genen/markers. Voor immunohistologische analyse moet het menselijk weefselmonster eerst in 4% Paraformaldehyde worden opgelost gedurende ten minste 48 uur en vervolgens in een buisje met 70% ethanol gedurende ten minste 16 uur. Gebruik dit vaste weefsel voor het maken van een paraffine-ingebed blok en snijd 5 μm dik weefsel delen met behulp van een weefsel-microtoom. Gebruik een borstel om elke snij sectie op een glazen glijbaan voorzichtig uit te spreiden voor vlekken. Vlek weefsel sectie dia met trichromen vlek voor het opsporen van collageen afzetting, en met αSMA vlek voor het opsporen van myofibroblasten (zie rubriek 3 voor gedetailleerde informatie over trichrome en αSMA kleuring). Onderzoek de bevlekte delen onder een lichte Microscoop. Verwerk een ander deel van het verkregen menselijk weefselmonster om eiwit lysaat te maken om αSMA via Western Blot te detecteren (zie rubriek 7 voor gedetailleerde informatie over de analyse van Western Blot). Verkrijg RNA van het laatste deel van het menselijk weefselmonster met behulp van een extractie reagens (tabel met materialen) en converteer mRNA naar cDNA via RT-PCR. Analyseer fibrotische en cytokine genen door qPCR (zie rubriek 6 voor gedetailleerde informatie over de bereiding van mRNA). 2. inductie van TNBS fibrose en rapamycine behandeling bij muizen Voer dierlijk onderzoek uit volgens de door de instelling goedgekeurde dierenonderzoekprotocollen. Scheer volwassen muizen rond het nekgedeelte om vooraf te sensibiliseren voor TNB’S via dermale blootstelling. Week TNBS in een wattenstaafje en breng TNBS aan op het geschoren gedeelte van de muis nek.Opmerking: pre-sensibilisatie is een zeer belangrijke stap, omdat het vertraagde overgevoeligheids respons verbetert om TNBS-gemedieerde ontstekingen te initiëren. Acht dagen na pre-sensibilisatie, induceren colitis door intra-rectale toediening eenmaal per week gedurende zes weken. Breng vier mg TNBS (in 25% ethanol) met behulp van een 100 μL klysma via een 1 mL spuit bevestigd aan een 3,5 Franse polyurethaan katheter en geef controle muizen 100 μL van 25% ethanol alleen. Anesthetiseer muizen met pentobarbital (25 mg/kg intraperitoneaal) of bloot ze aan 2,5% Isofluraan samen met 1 L/min van zuurstof tijdens de toediening van tnbs. Bevestig anesthetisering door zachtjes knijpen tenen en op zoek naar een afwezigheid van reflex. Gebruik veterinaire zalf op de ogen om droogheid te voorkomen, terwijl muizen onder anesthesie zijn. Injecteer rapamycine bij 2 mg/kg/dag of voertuig (5% tween-20 en 4% ethanol) elke weekdag gedurende 3-6 weken, intraperitoneaal, voor zowel controle-als TNBS-behandelde muizen. Gebruik 6 weken TNBS post-behandelde muizen darm voor het analyseren van de extracellulaire assays met inbegrip van histologie, flow cytometrie, Western blotting en RNA-extractie. Om organen te oogsten, te euthanasie muizen met CO2 inademing en te bevestigen euthanasisch met cervicale dislocatie. Om organen te oogsten, te euthanasie muizen met CO2 inademing en te bevestigen euthanasisch met cervicale dislocatie. Na euthanasie opent lengterichting de muis op zijn ventrale kant met behulp van een schaar en een tang van chirurgische kwaliteit. Verwijder de gehele dikke darm van het rectum naar de terminale darmbeen zone. Breng de dubbele punt snel over naar ijskoud 1x HBSS en was de dikke darm met dezelfde buffer. Meet en vergelijk de Colon lengtes van de controle-en TNBS-behandelde muizen. Doe deze stap zo snel mogelijk om uitdroging uit de dubbele punten te voorkomen om celsterfte te voorkomen. Snijd de dikke darm in kleine stukjes en houd bij-80 °C voor opslag voor toekomstige doeleinden (RNA/Western Blot-analyse). Gebruik een ander stukje van de dikke darm voor FACS analyse. Zorg ervoor dat u snijden en verzamelen van Colon weefselmonsters uit soortgelijke gebieden van de dikke darm van zowel controle en tnbs behandelde dieren.Opmerking: een sterfte van 10%-20% wordt verwacht met TNBS-inoculatie, hoewel met ervaring, het sterftecijfer aanzienlijk kan worden verminderd. 3. Immuno-histopathologische beoordeling van darm fibrose Fix mens en/of muizen weefsels in 4% Paraformaldehyde voor 48 h, en vervolgens overbrengen naar 70% ethanol voor 16 uur.Opmerking: Paraformaldehyde is een neurotoxische stof, dus vermijd inademing; Gebruik een gezichtsmasker tijdens het gebruik. Paraffine sluit de vaste Colon weefsels, snijd op een dikte van 5 μm, en direct zet de weefsels op glasplaten voor histologie. Voer H & E en trichrome blauwkleuring volgens de instructies van de fabrikant om collageen te detecteren. Kort, eerste deparaffineze secties door het subfusie van de dia met secties in twee kamers van xyleen voor 5 minuten in elke kamer. Spoel dia’s met 100% alcohol gedurende 1 minuut; Herhaal deze stap drie keer. Spoel opnieuw met kraanwater gedurende 1 minuut. Daarna, dompel dia’s in voorverwarmde Bouin’s oplossing bij 56 °C gedurende 60 min. de oplossing van Bouin is geel van uiterlijk; was na het uitnemen van de dia’s uit de oplossing van Bouin in kraanwater gedurende 3 min of totdat de glaasjes kleurloos werden. Dompel dia’s in gemodificeerde Mayer’s Hematoxylin-oplossing gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur. Stain dia’s door onderdompelen in trichrome vlek voor 5-8 min. onmiddellijk spoelen in stromend water voor 5-10 s om overtollige Trichromen vlek te verwijderen. Dehydraat dia’s met 100% alcohol gedurende 1 min. Herhaal deze procedure drie keer. Wis dia’s met xyleen gedurende 1 minuut en herhaal de stap 3x. Koppel dia’s met bevestigingsmateriaal (Inhoudsopgave). Houd de afdekplaat aan de ene kant voorzichtig vast met de Tang en laat deze de hele sectie bedekken zonder bubbels. Als er enkele bubbels zijn, verwijder dan snel bubbels door op de dekslip te tikken. Gebruik immunokleuring om αSMA te detecteren. Blokkeer Colon secties in blokkerende buffer (0,2% Triton X-100 en 5% normaal geiten serum in 1x PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Inbroed met 100 μL verdund primair antilichaam voor αSMA (tabel van de materialen) op de dia oplossing (0,2% Triton X-100 en 3% normaal geiten serum in 1x PBS; anti-αsma 1:200) bij 4 °c ‘s nachts. Was de secties drie keer met 1x PBS. Gebruik geit anti-muis IgG (H + L) geconjugeerd met Alexa Fluor 488 (tabel van de materialen) als secundair antilichaam voor 2 uur bij kamertemperatuur. Was de secties drie keer met 1x PBS. Gebruik DAPI om de Nucleus 5 minuten tegen te gaan. Was de secties drie keer met 1x PBS. Monteer dia’s met fluorescerende bevestigingsmateriaal (inhoudstafel) en sluit af met een dekslip met nagellak. Verkrijg afbeeldingen met behulp van de LSM 880 confocale Microscoop en proces beelden met behulp van Microscoop software. Kwantificeer afbeeldingen door gemiddeld meerdere geselecteerde gebieden in dezelfde sectie te nemen met ImageJ. 4. isolatie van intestinale lamina propria en zuivering van Cx3Cr1+ mononucleaire fagocyten Longitudinally Open de dikke darm in ijskoude Hank de uitgebalanceerde zoutoplossing (HBSS; Tabel met materialen) en was de dikke darm met dezelfde buffer. Snijd ongeveer 5 cm kleine stukjes dikke darm weefsels met behulp van steriele schaar in HBSS. Breng kleine stukjes Colon weefsel in een conische buis van 50 mL met 10 mL pre-digestie buffer (1x HBSS met 5% FBS, 5 mM EDTA en 1 mM DTT), en schud gedurende 20 min bij 100 rpm in een 37 °C incubator11.Opmerking: incubatie van het Colon weefsel in 37 °C bij 100 RPM schud conditie zorgt voor een efficiënte spijsvertering van Collagenase weefsel en een hoge opbrengst van levensvatbare cellen. Gooi vrijstaande Colon epitheel weg door het passeren van een 40 μm celzeef. Verzamel het overgebleven weefsel van de zeef en verover ze verder in de digestie buffer met collagenase type IV en DNase I (tabel met materialen) in 1x HBSS met 5% FBS gedurende 20 minuten bij 37 °c bij 100 rpm. Vortex de verteerde weefsels voor ongeveer 20 sec. en passeren een 40 μm celzeef om lamina propria fracties te verkrijgen. Centrifuge de lamina-propria-fracties tot pellet in de cellen bij 700 x g in 4 °c Om dode cellen uit de lamina propria uit te sluiten, gebruikt u een dichtheidsgradiënt (tabel met materialen).Opmerking: de dichtheidsgradiënt media die hier worden gebruikt (tabel met materialen) kunnen leiden tot verlies van mononucleaire cellen; echter, het sterk verwijdert dode cellen uit de voorbereiding, die over het algemeen verhoogt de zuiverheid. Maak 100 mL elk van 30% en 70% dichtheidsgradiënt media-oplossingen. Respendeer de verkregen cellen in 10 mL van de 30%-oplossing en overlay bovenop 5 mL van de 70%-oplossing in een buis van 15 mL. Centrifugeer het verloop in een rem-vrije toestand bij 1.000 x g en kamertemperatuur. Verzamel de witte ring fase met lamina propria lymfocyten, die zal liggen tussen de 30% en 70% gradiënt lagen. Was de verkregen cellen door opnieuw op te schorten in ijskoude HBSS en centrifugeer bij 500 x g, 20 °c, gedurende 10 min. resuspendeer cellen in FACS (fluorescentie-geactiveerde celsortering) buffer (PBS, pH 7,4, met 1% BSA en 2 mm EDTA). Purify mononucleaire fagocyten uit de verzamelde cellen zuivering met behulp van magnetische kralen en/of FACS sortering. Magnetische zuivering Voorafgaand aan kleuring met antilichamen, eerste blok celoppervlak van lamina propria cellen door inbrokkelend met anti-muis CD16/CD32 FC Blocker voor 15 min op ijs. Inincuberen cellen met anti-Cx3Cr1-PE (phycoerythrin) antilichamen samen met anti-PE microbeads (tabel van de materialen) voor 30 min op ijs, om de gebonden cellen vast te leggen. Spoel cellen met FACS buffer. Geef de antilichamen/kraal gebonden cellen door een magnetisch geactiveerde cel-sorteerkolom in een magnetisch veld om niet-afhankelijke cellen te verwijderen. Was drie keer met FACS buffer. Verwijder de kolom uit het magnetische veld en duw de zuiger in de kolom om Bead gebonden cellen te leveren. FACS sorteringOpmerking: FACS sorting kan worden gebruikt ter vervanging van magnetische zuivering. Hoewel magnetische zuivering een eenvoudige en kosteneffectieve methode is, is het beperkt tot alleen het zuiveren van enkelvoudige cellen, niet voor subpopulaties van cellen. Daarom, om subpopulaties van cellen te isoleren, is de FACS sorteermethode een effectieve methode voor het sorteren van afzonderlijke cellen en subpopulaties van cellen. Blok lamina propria cellen met anti-muis CD16/CD32 FC Blocker (tabel van de materialen). Beits cellen door inbroed met anti-CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C en MHCII antilichamen. Sorteer met behulp van een FACS flow cytometer, gating voor CD11c-CD64+ CD11b+ Cx3Cr1+ Ly6C- cellen om de Cx3Cr1 (P3 + P4) populatie te zuiveren. Lyse gesorteerde cellen voor totale RNA-bereiding en Detecteer cytokine-en fibrotische markers (zie rubriek 6 voorbereiding van RNA en cDNA). Analyseer mRNA-expressie van fibrotische markers en inflammatoire cytokine-analyse van geïsoleerde eencellige suspensies van magnetische zuivering. Voor FACS analyse, Blokkeer cellen met anti-muis CD16/CD32 FC Blocker (tabel van de materialen) voorafgaand aan kleuring met antilichamen tegen oppervlak of intracellulaire markers. 5. Flowcytometrie analyse Celoppervlakte kleuring en-analyse Respenderen 5-10 × 105 geïsoleerde lamina propria cellen in 50 ml FACS buffer (1% BSA, 2 mm EDTA in PBS, pH 7,4). Inincuberen cellen met anti-muis CD16/CD32 (tabel van de materialen) bij een 1:50 verdunning te blokkeren FC receptoren op ijs voor 10 min. Spoel cellen met 500 μL ijskoude FACS-buffer om ongebonden anti-CD16/CD32 te verwijderen voordat de celoppervlakte wordt gekleurd. Oppervlakte vlek Colon eencellige suspensies (106 cellen/50 ml) met fluorescerend gelabeld antilichaam bij 1:100 verdunning op ijs gedurende 30 minuten om de Colon lamina propria te evalueren. Was gelabelde cellen tweemaal met 500 μL ijskoude FACS buffer om ongebonden antilichamen te verwijderen. Analyseer gelabelde mononucleaire cellen door Flowcytometrie. Gate for Live, dan voor FSC+SSC+ gevolgd door CD11b+ Cx3Cr1+, en analyseer vervolgens andere macrofaag activerings markers, waaronder mhcii, CD80, CD86 en CD40. Intracellulaire cytokine-kleuring en-analyse Voor intracellulaire cytokine kleuring, Fix en permeabilize de oppervlakte-gekleurd cellen met behulp van een fixatie/Permeabilization Solution Kit (tabel van materialen); Volg de instructies van de fabrikant voor gedetailleerde stappen. Gate lamina propria cellen voor Live, dan voor FSC+SSC+ gevolgd door CD11b+ Cx3Cr1+IL23+ voor het detecteren van intracellulaire niveau van IL23 cytokine en CD11b+ Cx3Cr1+IL1β+ aan Detecteer intracellulaire niveau van IL1β cytokine. αSMA kleuring en analyse Spoel cellen met FACS buffer tweemaal door centrifugeren bij 200 x g en 4 °c gedurende 5 minuten om overtollige fixatieve buffer te verwijderen. Om het αSMA niveau te bepalen, permeabilize cellen met een fixatie/Permeabilization Solution Kit (tabel van materialen). Incuberen cellen met anti-αSMA-AF488 antilichaam (Inhoudsopgave) met 1:1000 verdunning op ijs gedurende 30 minuten. Was de cellen twee keer en vervolgens FACS analyse. Gate for Live, FSC+SSC+ gevolgd door detectie van αsma+ cellen in Colon cellen. 6. RNA-isolatie, RT-PCR, real-time PCR Isoleren van RNA van MACS of FACS gezuiverde cellen of Colon weefsel door homogeniseren in extractie reagens (tabel van materialen).Opmerking: gebruik een veiligheidsbril en andere beschermende uitrusting voor laboratoria wanneer u met dit reagens werkt, omdat het een Long-en huidirritatie is. Werk veilig in een afzuigkap. Voeg 0,5 μL RNase-vrij glycogeen toe uit 20 μg/mL glycogeenvoorraad oplossing (tabel met materialen) om het herstel van het totale RNA te verbeteren voorafgaand aan het neerslaan van RNA met isopropanol. Rebreng de RNA-pellet in 50 μL RNase vrij water (tabel met materialen) en inincuberen bij 55 °c gedurende 5 minuten om het RNA-gehemelte volledig op te lossen. Lees RNA concentraties met behulp van een spectrofotometer bij 260 nm. Synthetiseren cDNA met behulp van 1 μg totaal RNA en een omgekeerde transcriptie synthese Kit (tabel van materialen). Analyseer genexpressie met 2 μL cDNA als templates via real-time PCR. Gebruik een 96-well PCR-plaat qPCR Master Mix Kit (tafel van materialen). Gebruik CT-waarden voor het berekenen van de vouw verandering van RNA overvloed na het normaliseren van de GAPDH/HPRT waarden. 7. Western blotting Lyse Colon weefsel met behulp van RIPA lysisbuffer (1% NP40). Los proteïne lysaat op in een 8% bis-tris gel met een constante spanning van 80 V. Breng gel-eiwitten over naar nitrocellulose membraan (en) in koude overdrachts buffer met een constante stroom van 50 mA gedurende 2 uur bij 4 °C. Blokkeer niet-specifieke gebieden op het eiwit overgedragen membraan met 5% niet-vette melk in TBST (25 mM tris-HCl, pH 7,4, 1,5 M NaCl, 0,05% Tween-20) gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur. Om αSMA-niveaus te detecteren, moet u het membraan (s) met het primaire detectie-antilichaam αSMA bij 4 °C ‘s nachts inbroed. Wassen membranen 3-4 keer met behulp van TBST in 15 min intervallen. Inincuberen met HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (1:10000) in 5% niet-vette melk in TBST. Ontwikkelen van membranen met behulp van een ECL ontwikkelen Kit. Normaliseren eiwit signaal intensiteiten met GAPDH als een laad regeling voor densitometrie analyse. 8. statistische analyse Analyseer de gegevens met behulp van data-analyse software naar keuze door het vergelijken van wild type en KO-dieren. Houd rekening met de P-waarde van < 0,05 significant (* P < 0,05; * * P < 0,01; * * * P < 0,001). Gebruik de t-toets van de student om de verschillen tussen twee groepen en ANOVA-test voor analyse tussen meer dan twee groepen te testen.