Approfondimenti meccanicistici sullo sviluppo della fibrosi intestinale mediata dalla TNBS e sulla valutazione degli effetti inibitori della rapamicina

Per questo manoscritto, tutti i campioni umani sono stati acquistati secondo il protocollo approvato dall’Institute Review Board (IRB) e dal Comitato per la ricerca umana presso l’Albany Medical College. Tutte le ricerche che coinvolgono gli animali sono state rigorosamente seguite secondo il protocollo approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali dell’Albany Medical College e dal National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals . 1. Raccolta di campioni intestinali umani Raccogliere campioni di tessuto umano secondo i protocolli del comitato di ricerca dell’istituzione. Procurare il tessuto intestinale (ileocolonico) di un paziente CD diagnosticato con fibrosi e campioni di controllo da pazienti senza storia di IBD. Utilizzare parte del tessuto intestinale per l’immunohistologia, un’altra parte del tessuto per l’analisi dell’mRNA e una parte finale per l’espressione proteina di geni/marcatori fibrotici e citochini. Per l’analisi immunoistologia, prima fissare il campione di tessuto umano in 4% paraformaldeide per almeno 48 h e poi trasferirlo in un tubo contenente 70% etanolo per almeno 16 h. Utilizzare questo tessuto fisso per fare un blocco di paraffina incorporato e tagliare il tessuto spesso 5 m sezioni utilizzando un microtoma tissutale. Utilizzando un pennello, stendere delicatamente ogni sezione tagliata su uno scivolo di vetro per la colorazione. La sezione del tessuto macchiato scorre con macchia tricromatica per rilevare la deposizione di collagene, e con la macchia di sMA per rilevare i miofibromi (vedere la sezione 3 per informazioni dettagliate sul tricromo e la colorazione di .SMA). Esaminare le sezioni colorate al microscopio luminoso. Elaborare un’altra parte del campione di tessuto umano ottenuto per produrre il lisa tobreo proteico per rilevare la SMA tramite macchia occidentale (vedere la sezione 7 per informazioni dettagliate sull’analisi delle macchie occidentali). Ottenere RNA dalla parte finale del campione di tessuto umano utilizzando un reagente di estrazione (Tabella dei materiali) e convertire l’mRNA in cDNA tramite RT-PCR. Analizzare i geni fibrotici e citochine da qPCR (vedere la sezione 6 per informazioni dettagliate sulla preparazione dell’mRNA). 2. Induzione della fibrosi TNBS e del trattamento con rapamici nei topi Effettuare ricerche sugli animali secondo i protocolli di ricerca sugli animali approvati dall’istituzione. Rasare topi adulti intorno alla zona del collo al fine di pre-sensibilizzare a TNBS tramite esposizione dermica. Immergere il TNBS in un tampone di cotone e quindi applicare il TNBS all’area rasata del collo del mouse.NOTA: La pre-sensibilizzazione è un passo molto importante in quanto migliora la risposta di ipersensibilità ritardata per avviare l’infiammazione mediata da TNBS. Otto giorni dopo la pre-sensibilizzazione, indurre la colite per somministrazione intra-rettale una volta alla settimana per sei settimane. Applicare quattro mg di TNBS (nel 25% di etanolo) utilizzando un enema di 100 ll usando una siringa da 1 mL attaccata a un catetere in poliuretano francese 3,5 e dare ai topi di controllo 100 – L del 25% di etanolo solo. Anestesizza i topi con pentobarbital (25 mg/kg intraperitoneali) o li esponi al 2,5% di isoflurane insieme a 1 L/min di ossigeno durante la somministrazione di TNBS. Confermare l’anestesizzazione pizzicando delicatamente le dita dei pipi’ e cercando un’assenza di riflesso. Utilizzare unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza mentre i topi sono in anestesia. Iniettare la rapamicina a 2 mg/kg/giorno o veicolo (5% Tween-20 e 4% di etanolo) ogni giorno feriale per 3-6 settimane, intraperitoneali, sia ai topi di controllo che a quelli trattati con TNBS. Utilizzare 6 settimane TNBS mice intestino per analizzare i saggi extracellulari tra cui istometria, citometria di flusso, gonfiore occidentale ed estrazione di RNA. Per raccogliere gli organi, eutanasia i topi utilizzando l’inalazione di CO2 e confermare l’eutanasia con lussazione cervicale. Per raccogliere gli organi, eutanasia i topi utilizzando l’inalazione di CO2 e confermare l’eutanasia con lussazione cervicale. Dopo l’eutanasia, longitudinalmente aprire il topo sul suo lato ventrale utilizzando forbici e pinze di grado chirurgico. Rimuovere l’intero colon dal retto all’area terminale dell’ilium. Trasferire rapidamente il colon a freddo ghiaccio 1x HBSS e lavare il colon utilizzando lo stesso tampone. Misurare e confrontare le lunghezze dei due punti del controllo e dei topi trattati con TNBS. Fare questo passo il più velocemente possibile per evitare l’essiccazione dei coloni al fine di evitare la morte delle cellule. Tagliare il colon a piccoli pezzi e mantenere a -80 gradi centigradi per lo stoccaggio per scopi futuri (RNA/analisi delle macchie occidentali). Utilizzare un’altra parte del colon per l’analisi FACS. Assicurarsi di tagliare e raccogliere campioni di tessuto colonico da regioni simili del colon di entrambi gli animali di controllo e TNBS trattati con TNBS.NOTA: si prevede una mortalità del 10%-20% con l’inoculazione di TNBS anche se con l’esperienza, il tasso di mortalità può essere significativamente ridotto. 3. Valutazione immuno-istopatologica della fibrosi intestinale Fissare i tessuti umani e/o topi nel 4% di paraformaldeide per 48 h, e quindi trasferire al 70% di etanolo per 16 h.NOTA: La paraformaldeide è una sostanza chimica neurotossica, quindi evita l’inalazione; utilizzare una maschera per il viso durante l’utilizzo. La paraffina incorpora i tessuti fissi del colon, affetta ad uno spessore di 5 m e mette direttamente i tessuti sui vetrini di vetro per l’istologia. Eseguire la colorazione H&E e Trichrome Blue secondo le istruzioni del produttore per rilevare il collagene. In breve, prima deparaffinare le sezioni sommergendo il vetrino contenente sezioni in due camere di xilene per 5 min in ogni camera. Risciacquare i vetrini con alcool al 100% per 1 min; ripetere questo passaggio tre volte. Risciacquare di nuovo con acqua del rubinetto per 1 min. Dopo di che, immergere i vetrini nella soluzione preriscaldata di Bouin a 56 s per 60 min. la soluzione di Bouin è di aspetto giallo; lavare dopo aver tolto i vetrini dalla soluzione di Bouin in acqua di rubinetto per 3 min o fino a quando i vetrini diventano incolore. Immergiti in vetrini nella soluzione Hematoxylin di Modified Mayer per 7 min a temperatura ambiente. Scivoli macchiati immergendosi in colorazione Trichrome per 5-8 min. Immediatamente, risciacquare i vetrini in acqua corrente per 5-10 s per rimuovere l’eccesso di macchie Trichrome. Disidratare i vetrini con alcool al 100% per 1 min. Ripetere questa procedura tre volte. Cancellare le diapositive con xilene per 1 min e ripetere il passaggio 3x. Montare diapositive con supporti di montaggio (Tabella dei materiali). Tenere con attenzione coverslip ad un’estremità con pinze e lasciarlo coprire l’intera sezione senza avere bolle. Se ci sono alcune bolle, rimuovere rapidamente le bolle toccando il coperchio. Utilizzare l’immunostaining per rilevare l’SMA. Bloccare le sezioni dei due punti nel buffer di blocco (0,2% Triton X-100 e 5% siero di capra normale in 1x PBS) per 1 h a temperatura ambiente. Incubare con 100 LL l di anticorpo primario diluito per la SMA (Tabella dei Materiali) sulla soluzione di scorrimento (0,2% Triton X-100 e 3% siero di capra normale in 1x PBS; anti-SMA 1:200) a 4 gradi durante la notte. Lavare le sezioni tre volte con 1x PBS. Utilizzare l’anti-tono della capra IgG (H e L) coniugato con Alexa Fluor 488 (Tabella dei materiali) come anticorpo secondario per 2 h a temperatura ambiente. Lavare le sezioni tre volte con 1x PBS. Utilizzare DAPI per contrastare il nucleo per 5 min. Lavare le sezioni tre volte con 1x PBS. Montare i vetrini con supporti di montaggio fluorescenti (Tabella dei materiali) e sigillare con una vetrina con smalto. Acquisire immagini utilizzando il microscopio confocale LSM 880 ed elaborare le immagini utilizzando il software al microscopio. Quantifica le immagini prendendo una media di più aree selezionate nella stessa sezione con ImageJ. 4. Isolamento della mimina intestinale e purificazione di Cx3Cr1- fagociti mononucleari Longitudinalmente aprire il colon in gelido Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS; Tabella dei materiali) e lavare i due punti con lo stesso buffer. Tagliare circa 5 cm piccoli pezzi di tessuti del colon utilizzando forbici sterili in HBSS. Trasferire piccoli pezzi di tessuto del colon in un tubo conico da 50 mL contenente 10 mL di tampone di pre-digestione (1x HBSS con 5% FBS, 5 mM EDTA e 1 mM DTT), e agitare per 20 min a 100 rpm in un incubatore di 37 gradicentigradi 11.NOTA: L’incubazione del tessuto colonico in 37 gradi centigradi a 100 rpm shaking condizione consente una digestione efficiente del tessuto di collagenasi e un’elevata resa di cellule vitali. Eliminare l’epitelio colonico staccato passando attraverso un colino cellulare di 40 m. Raccogliere il tessuto rimanente dal colino e digerirli ulteriormente nel buffer di digestione contenente Collagenase tipo IV e DNase I (Tabella dei materiali) in 1x HBSS con 5% FBS per 20 min a 37 s a 100 rpm. Vorticare i tessuti digeriti per circa 20 s e passare attraverso un colino cellulare di 40 m per ottenere frazioni propria di lamina. Centrifugare la lamina propria frazioni per pellet giù le cellule a 700 x g in 4 gradi centigradi Per escludere le cellule morte dalla lamina propria utilizzare un gradiente di densità (Tabella dei materiali).NOTA: il supporto sfumato di densità utilizzato qui (Tabella dei materiali) può causare la perdita di cellule mononucleari; tuttavia, rimuove notevolmente le cellule morte dalla preparazione, che nel complesso aumenta la purezza. Crea soluzioni multimediali per gradienti da 100 mL ciascuna del 30% e 70%. Risospendere le cellule ottenute in 10 mL della soluzione 30% e sovrapporle a 5 mL della soluzione 70% in un tubo da 15 mL. Centrifugare il gradiente in condizioni senza freni a 1.000 x g e temperatura ambiente. Raccogliere la fase ad anello bianco contenente lamina proprialymphocites, che sarà tra il 30% e 70% strati gradiente. Lavare le cellule ottenute sospendendo nuovamente in HBSS ghiacciato e centrifugare a 500 x g, 20 s, per 10 m. Re-sospendi le cellule in FACS (fluorescence-activated cell sorting) buffer (PBS, pH 7.4, con 1% BSA e 2 mM EDTA). Purificare i fagociti mononucleari dalla purificazione delle cellule raccolte utilizzando perline magnetiche e/o smistature FACS. Depurazione magnetica Prima di colorare con anticorpi, primo blocco della superficie cellulare delle cellule propria di lamina incubando con anti-topo CD16/CD32 Fc bloccante per 15 minuti sul ghiaccio. Incubare cellule con anticorpi anti-Cx3Cr1-PE (phycoerythrin) insieme a microsfere anti-PE (Tabella dei materiali) per 30 min sul ghiaccio, per catturare le cellule legate. Lavare le celle con buffer FACS. Passare le cellule legate anticorpo/perline attraverso una colonna di smistamento delle cellule magnetica in un campo magnetico per rimuovere le cellule non associate. Lavare tre volte con il buffer FACS. Rimuovere la colonna dal campo magnetico e spingere lo stantuffo nella colonna per produrre le celle legate al tallone. Ordinamento FACSNOTA: lo smistamento FACS può essere utilizzato al posto della purificazione magnetica. Anche se la purificazione magnetica è un metodo facile ed economico, è limitata alla sola purificazione di singole cellule, non alle sottopopolazioni di cellule. Pertanto, per isolare le sottopopolazioni di cellule, il metodo di smistamento FACS è un metodo efficace per ordinare singole cellule e sottopopolazioni di cellule. Bloccare le celle di lamina propria con blocco CD16/CD32 Fc anti-mouse(Tabella dei materiali). Stacito incubando con anticorpi anti-CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C e MHCII. Ordinare utilizzando un citometro di flusso FACS, gating per CD11c-CD64- CD11b- Cx3Cr1- Ly6C- celle per purificare la popolazione CX3Cr1 (P3 – P4). Le cellule sortite di lisce per la preparazione totale dell’RNA e rilevano i marcatori citochine e fibroti (vedere la sezione 6 per la preparazione di RNA e cDNA). Analizza l’espressione dell’mRNA dei marcatori fibrotici e l’analisi infiammatoria della citochina dalle sospensioni isolate a singola cellula dalla purificazione magnetica. Per l’analisi FACS, bloccare le cellule con bloccante anti-topo CD16/CD32 Fc (Tabella dei materiali) prima della colorazione con anticorpi contro i marcatori superficiali o intracellulari. 5. Analisi della citometria di flusso Colorazione e analisi della superficie cellulare Risospendere 5-10 x 105 cellule isolate di lamina propria in 50 mL di buffer FACS (1% BSA, 2 mM EDTA in PBS, pH 7.4). Incubare cellule con anti-mouse CD16/CD32 (Tabella dei Materiali) ad una diluizione 1:50 per bloccare i recettori Fc sul ghiaccio per 10 min. Lavare le cellule con 500 tamponi FACS ghiacciati per rimuovere l’anti-CD16/CD32 non legato prima della colorazione della superficie cellulare. Sospensioni a celle unifamiliari con macchie superficiali (106 celle/50 mL) con anticorpi fluorescenti etichettati a 1:100 didiluizione sul ghiaccio per 30 min per valutare lamina colonica. Lavare due volte le cellule etichettate con 500 l di tampone FACS ghiacciato per rimuovere gli anticorpi non legati. Analizzare le cellule mononucleari etichettate dalla citometria di flusso. Gate for Live, quindi per FSC,SSC, seguito da CD11be Cx3Cr1 , quindi analizza altri marcatori di attivazione del macrofagio, tra cui MHCII, CD80, CD86 e CD40. Colorazione e analisi della citochina intracellulare Per la colorazione intracellulare della citochina, fissare e permeabilizzare le cellule macchiate di superficie utilizzando un kit di soluzione di fissazione/permeabilizzazione (Tabella dei materiali); seguire le istruzioni del produttore per la procedura dettagliata. Cancello cellule di lamina per Live, poi per FSC-SSC, seguito da CD11b, Cx3Cr1,IL23, per rilevare il livello intracellulare di citochina IL23 e CD11b, Cx3Cr1,IL1, a rilevare il livello intracellulare di citochina IL1. Colorazione e analisi SMA Lavare due volte le cellule con buffer FACS centrifugando a 200 x g e 4 gradi centigradi per 5 min per rimuovere il buffer fissativo in eccesso. Per determinare il livello di SMA, permeabilizzare le celle con un kit di soluzioni di fissazione/permeabilizzazione (Table of Materials). Incubare cellule con anticorpi anti-SMA-AF488 (Tabella dei materiali) utilizzando 1:1.000 diluizione sul ghiaccio per 30 min. Lavare le cellule due volte e poi fare analisi FACS. Gate for Live, FSC-SSC- seguito dal rilevamento dicelle nelle celle coloniche. 6. Isolamento dell’RNA, RT-PCR, PCR in tempo reale Isolare l’RNA da cellule MACS o FACS purificate o tessuto eccitato dal colon omogeneizzandoli nel reagente di estrazione (Tabella dei materiali).NOTA: Utilizzare occhiali di sicurezza e altri dispositivi di laboratorio quando si lavora con questo reagente in quanto è un polmone e pelle irritante. Lavora in sicurezza in un cappuccio. Aggiungete 0,5 l di glicogeno privo di RNase dalla soluzione di riserva di glicogeno a 20 g/mL (Tabella dei materiali) per migliorare il recupero dell’RNA totale prima della precipitazione dell’RNA con isopropanolo. Risospendere il pellet di RNA in 50 gradi l di RNase acqua libera (Tabella dei materiali) e incubare a 55 gradi centigradi per 5 min per sciogliere completamente il palato dell’RNA. Leggere le concentrazioni di RNA utilizzando uno spettrofotometro a 260 nm. Sintetizza il cDNA usando 1 g di RNA totale e un kit di sintesi della trascrizione inversa (Tabella dei materiali). Analizzare l’espressione genica utilizzando 2 l di cDNA come modelli tramite PCR in tempo reale. Utilizzare un kit PCR qPCR Master Mix di 96 pozze(Table of Materials). Utilizzare i valori CT per calcolare la variazione di piegatura dell’abbondanza di RNA dopo la normalizzazione dei valori GAPDH/HPRT. 7. Gonfiore occidentale Tessuto colondico Lyse utilizzando il buffer di lisi RIPA (1% NP40). Risolvere il lisate proteico in un gel bis-Tris dell’8% a una tensione costante di 80 V. Trasferire la proteina gel nella membrana di nitrocellulosa in tamponare a freddo rincorrere a una corrente costante di 50 mA per 2 h a 4 gradi centigradi. Bloccare le regioni non specifiche sulla membrana trasferita proteina utilizzando il 5% di latte non grasso in TBST (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1,5 M NaCl, 0,05% Tween-20) per almeno 1 h a temperatura ambiente. Per rilevare i livelli di SMA, incubare la membrana(e) con l’anticorpo di rilevamento primario di .SMA a 4 gradi centigradi durante la notte. Lavare le membrane 3-4 volte utilizzando TBST in intervalli di 15 min. Incubare con anticorpo secondario coniugato HRP (1:10,000) nel 5% di latte non grasso in TBST. Sviluppare membrane utilizzando un kit di sviluppo ECL. Normalizza le intensità del segnale proteico con GAPDH come controllo di carico per l’analisi della densitometria. 8. Analisi statistica Analizzare i dati utilizzando il software di analisi dei dati di scelta confrontando tra animali selvatici e KO. Considerare il valore P di <0.05 come significativo (Sezione P < 0,05; . Utilizzare il test t di Student per testare le differenze tra due gruppi e il test ANOVA per l’analisi tra più di due gruppi.