Einführung eines Gene Knockout direkt in die Amastigote-Phase von Trypanosoma cruzi mit dem CRISPR/Cas9-System

Trypanosoma cruzi ist der Erreger der Chagas-Krankheit, die vor allem in Lateinamerika vorherrscht¹. T. cruzi hat auf der Reise zwischen einem Insektenvektor und einem Säugetierwirt²unterschiedliche Lebenszyklusstadien. T. cruzi repliziert als Epimastigot im Mittelgut eines blutsaugenden Triatomin-Bugs und differenziert sich in seinem Hintergut zu einem infektiösen metazyklischen Trypomastigot, bevor er auf einem menschlichen oder tierischen Wirt abgelagert wird. Sobald der Trypomastigot durch die Bissstelle oder durch eine Schleimhaut in den Wirtskörper gelangt, dringt der Parasit in eine Wirtszelle ein und verwandelt sich in eine flagellalose runde Form, die als Amastigot bezeichnet wird. Der Amastigot repliziert sich innerhalb der Wirtszelle und differenziert sich schließlich in Trypomastigote, das aus der Wirtszelle platzt und in den Blutkreislauf eintritt, um eine andere Wirtszelle zu infizieren.

Da derzeit verfügbare Chemotherapeutika, Benznidazol und Nifurtimox Nebenwirkungen verursachen und in der chronischen Phase der Krankheit³unwirksam sind, ist es von großem Interesse, neuartige Wirkstoffziele gegen T. cruzi zu identifizieren. In den letzten Jahren hat sich das CRISPR/Cas9-System zu einem leistungsfähigen Werkzeug entwickelt, um Gen Knockout in T. cruzieffektiv durchzuführen, entweder durch Transfektion von separaten oder einzelnen Plasmiden, die gRNA und Cas9⁴enthalten, durch stabile Expression von Cas9 und Einführung von gRNA^5,6,7 oder Transkriptionsschablon von gRNA⁸, oder durch Elektroporation des vorgeformten gRNA/Cas9 RNP-Komplexes^7,9. Dieser technologische Fortschritt wird mit Spannung erwartet, um die Drogenzielforschung bei der Chagas-Krankheit zu beschleunigen.

Um mit der Arzneimittelentwicklung fortzufahren, ist es entscheidend, die Wesentlichkeit des Zielgens oder die Wirksamkeit von Wirkstoff-Kandidatenverbindungen im Amastigot von T. cruzizu validieren, da es sich um die Replikationsstufe des Parasiten im Säugetierwirt handelt. Dies ist jedoch eine schwierige Aufgabe, da Amastigoten aufgrund des Vorhandenseins einer obstruktiven Wirtszelle nicht direkt manipuliert werden können. In Leishmaniawurde ein eng verwandter protozoischer Parasit zu T. cruzientwickelt, eine axenische Amastigote-Kultivierungsmethode entwickelt und in den Arzneimittelscreening-Assays^{10,11,12 , 13}. Obwohl es einige Unterschiede in der Anfälligkeit für Verbindungen zwischen axtischen Amastigoten und intrazellulären Amastigoten¹⁴gibt, bietet die Fähigkeit, die axenische Kultur aufrechtzuerhalten, dennoch wertvolle experimentelle Werkzeuge, um die Grundbiologie des klinisch relevanten Stadiums von Leishmania^15,16. Im Fall von T. cruzistammen Literaturen über das Vorhandensein natürlich vorkommender extrazellulärer Amastigoten (EA)¹⁷ und die In-vitro-Produktion von EA^17,18,19 Jahrzehnten. Darüber hinaus ist EA bekannt, eine infektiöse Fähigkeit²⁰haben , wenn auch weniger als die von Trypomastigote, und der Mechanismus der amastigote Host Invasion wurde in den letzten Jahren aufgeklärt (rezensiert von Bonfim-Melo et al.²¹). Im Gegensatz zu Leishmaniawar EA jedoch nicht als Versuchswerkzeug in T. cruziverwendet worden, vor allem weil EA als obligate intrazellulärer Parasit angesehen worden war und daher in einer praktischen Form nicht als “replikative Form” betrachtet worden war. sinn.

Kürzlich schlug unsere Gruppe vor, EA von T. cruzi als zeitliche axenische Kultur zu nutzen²². Amastigotes des T. cruzi Tulahuen Stammes können sich bis zu 10 Tage lang frei von Wirtszellen in LIT-Medium bei 37 °C replizieren, ohne dass eine größere Verschlechterung oder Verlust amastigotähnlicher Eigenschaften entsteht. Während der wirtfreien Wachstumsphase wurde EA erfolgreich für die exogene Genexpression durch konventionelle Elektroporation, Arzneimitteltitrationstest mit trypanocidalen Verbindungen und CRISPR/Cas9-vermittelten Knockout gefolgt von einer Wachstumsphänotypüberwachung eingesetzt. In diesem Bericht beschreiben wir das detaillierte Protokoll zur Herstellung von in vitro abgeleiteten EA und zur Nutzung des axtischen Amastigots in Knockout-Experimenten.