Представляя ген нокаут непосредственно в Amastigote Этап trypanosoma cruzi Использование CRISPR / Cas9 системы

Трипаносома крузи является возбудимым возбудите болезнь Шагаса, которая распространена в основном в Латинской Америке¹. T. cruzi имеет отличительные этапы жизненного цикла, как он путешествует между насекомым вектор и млекопитающих хозяин². T. cruzi реплицирует сярлица в качестве эпиматигота в середине г. кровососущего триатомина и дифференцируется в инфекционный метациклический трипомэтигот в его заднухе перед тем, как оставить на человека или животного хозяина. Как только trypomastigote попадает в организм хозяина через место укуса или через слизистую оболочку, паразит вторгается в клетку-хозяина и превращается в флагелла менее круглая форма называется амасигот. Амасигот реплицируется внутри клетки-хозяина и в конечном итоге дифференцируется в трипоматигот, который вырывается из клетки-хозяина и входит в кровоток, чтобы заразить другую клетку-хозяина.

Поскольку в настоящее время доступны химиотерапевтические агенты, бензнидазол и нифуртимокс, вызывают неблагоприятные побочные эффекты и неэффективны в хронической фазе заболевания³, это представляет большой интерес для выявления новых целей наркотиков против T. cruzi. В последние годы, система CRISPR/Cas9 стала мощным инструментом для эффективного выполнения генного нокаута в T. cruzi, либо путем трансфекции отдельных или одной плазмиды (ы), содержащей gRNA и Cas9⁴, путем стабильного выражения Cas9 и последующего введение gRNA5,^6,7 или транскрипции шаблона gRNA⁸, или путем электропорации предварительно сформированного комплекса gRNA/Cas9 RNP^7,9. Этот технологический прогресс, как ожидается, ускорить целевое исследование наркотиков в области болезни Шагаса.

Чтобы продолжить разработку препарата, очень важно проверить существенность гена-мишени или эффективность соединений кандидата препарата в amastigote T. cruzi, так как это этап репликации паразита в млекопитающих хозяина. Однако, это трудная задача, потому что amastigotes не может быть непосредственно манипулировать из-за присутствия обструктивной ячейки хозяина. В Лейшмании, тесно связанных простейшие паразита T. cruzi, апорный метод культивирования amastigote был разработан и был использован в анализе скрининга наркотиков^{10,11,12, 13}. Хотя Есть некоторые расхождения в восприимчивости к соединениям между апорическими амастиготами и внутриклеточными амастиготами¹⁴, способность поддерживать топорную культуру, тем не менее, предоставляет ценные экспериментальные инструменты для изучения базовая биология клинически релевантной стадии Лейшмания^15,16. В случае T. cruzi, литературы о наличии естественных внеклеточных амастиготов (EA)¹⁷ и в пробирке производства EA^17,18,19 датируются десятилетия назад. Кроме того, Е.А., как известно, инфекционные возможности²⁰, хотя и меньше, чем у trypomastigote, и механизм вторжения амасигота принимающей была выяснена в последние годы (обзор Bonfim-Мело и др.²¹). Однако, в отличие от Leishmania,EA не был использован в качестве экспериментального инструмента в T. cruzi, в первую очередь потому, что EA считался обязанным внутриклеточным паразитом, и, таким образом, не рассматривался как “репликативная форма” в практической Смысле.

Недавно наша группа предложила использовать EA T. cruzi в качестве временной апорической культуры²². Amastigotes штамма T. cruzi Tulahuen может размножаться без клеток-хозяев в среде LIT при 37 градусах По Цельсия в течение 10 дней без серьезного ухудшения или потери амасиготных свойств. В период роста без хозяина, EA был успешно использован для экспрессии экзогенного гена обычным электропорированием, проверкой титрации препарата с трипаноцидальными соединениями и нокаутом CRISPR/Cas9 с последующим мониторингом фенотипа роста. В этом отчете мы описываем подробный протокол для производства in vitro, полученного EA, и использования аксена в экспериментах нокаута.