Presentazione di un Gene Knockout direttamente nello stadio Amastigote di Trypanosoma cruzi Utilizzando il sistema CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi è l’agente causale della malattia di Chagas, prevalente principalmente in America Latina¹. T. cruzi ha fasi del ciclo di vita distintive mentre viaggia tra un vettore di insetti e un ospite di mammiferi². T. cruzi si replica come un epimastigote nel midgut di un insetto di triatomina succhiasangue e si differenzia in una trypomastigote metaciclica infettiva nel suo intestino posteriore prima di essere depositato su un ospite umano o animale. Una volta che il trypomastigote entra nel corpo ospite attraverso il sito del morso o attraverso una membrana mucosa, il parassita invade una cellula ospite e si trasforma in una forma rotonda senza flagelli chiamata amastigote. L’amastigote si replica all’interno della cellula ospite e alla fine si differenzia in trypostigote, che esce dalla cellula ospite ed entra nel flusso sanguigno per infettare un’altra cellula ospite.

Dal momento che gli agenti chemioterapici attualmente disponibili, benznidazolo e nifurtimox, causano effetti collaterali negativi e sono inefficaci nella fase cronica della malattia³, è di grande interesse identificare nuovi bersagli farmacologici contro T. cruzi. Negli ultimi anni, il sistema CRISPR/Cas9 è diventato un potente strumento per eseguire efficacemente l’abbattimento genico in T. cruzi, sia per trasfezione di plasmide separate o singole contenenti gRNA e Cas9⁴, con espressione stabile di Cas9 e successiva introduzione di gRNA^5,6,7 o modello di trascrizione di gRNA⁸, o per elettroporazione del complesso gRNA/Cas9 RNP preformato^7,9. Questo progresso tecnologico è molto previsto per accelerare la ricerca sul target farmacologico nella malattia di Chagas.

Per procedere con lo sviluppo del farmaco, è fondamentale convalidare l’essenzialità del gene bersaglio o l’efficacia dei composti candidati al farmaco nell’amastigote di T. cruzi, in quanto è la fase di replicazione del parassita nell’ospite dei mammiferi. Tuttavia, questo è un compito impegnativo, perché gli amastigoti non possono essere manipolati direttamente a causa della presenza di una cellula ospite ostruttiva. In Leishmania, un parassita protozoo strettamente imparentato con T. cruzi, è stato sviluppato un metodo di coltura amastigote axenico ed è stato utilizzato nei prelievi di farmaci^{10,11,12, 13.}Sebbene vi siano alcune discrepanze nella suscettibilità ai composti tra amastigoti axenici e amastigoti intracellulari¹⁴, la capacità di mantenere comunque la cultura ascia fornisce preziosi strumenti sperimentali per studiare la biologia di base della fase clinicamente rilevante della Leishmania^15,16. Nel caso di T. cruzi, le pubblicazioni riguardanti la presenza di amastigotes extracellulari naturali (EA)¹⁷ e la produzione in vitro di EA^17,18,19 risalgono a decenni fa. Inoltre, EA è noto per avere una capacità infettiva²⁰, anche se inferiore a quella di trypomastigote, e il meccanismo di invasione dell’ospite amastigote è stato chiarito negli ultimi anni (rivisto da Bonfim-Melo et al.²¹). Tuttavia, a differenza della Leishmania, EA non era stato utilizzato come strumento sperimentale in T. cruzi, soprattutto perché EA era stato considerato come un parassita intracellulare obbligato, e quindi non era stato considerato come “forma replicativa” in un pratico senso.

Recentemente, il nostro gruppo ha proposto di utilizzare EA di T. cruzi come cultura axenica temporale²². Gli amastigotes del ceppo T. cruzi Tulahuen possono replicarsi senza cellule ospiti nel mezzo LIT a 37 gradi centigradi per un massimo di 10 giorni senza un grave deterioramento o perdita di proprietà simili ad amastigote. Durante il periodo di crescita senza ospiti, EA è stata utilizzata con successo per l’espressione genica esogena mediante elettroporazione convenzionale, l’analisi della titolazione dei farmaci con composti tributo e il knockout mediato da CRISPR/Cas9 seguito dal monitoraggio del fenotipo della crescita. In questo rapporto, descriviamo il protocollo dettagliato per produrre EA derivato in vitro e per utilizzare l’amastigote ascia negli esperimenti con knockout.