CRISPR/Cas9システムを用いたトリパノソマ・クルジのアマスティゴットステージに遺伝子ノックアウトを直接導入

トリパノソマ・クルジは、主に^{ラテンアメリカ1}で流行しているシャーガス病の原因となる薬剤である。T. クルジは、昆虫ベクターと哺乳類の宿主2の間を移動する独特のライフサイクルステージを持っています。T.クルジは、血液を吸うトリアトミンバグの中腸内のエピマスチゴテとして複製し、ヒトまたは動物の宿主に沈着する前に、その後腸内の感染性形而上皮トリポマスティゴに分化する。トリポマスティゴテが咬傷部位または粘膜を通して宿主体内に入ると、寄生虫は宿主細胞に侵入し、アマスティゴテと呼ばれるフラゲラレス丸型に変形する。amastigoteは宿主細胞内で複製し、最終的にはトリポマスティゴテに分化し、宿主細胞から破裂し、別の宿主細胞に感染するために血流に入る。

現在利用可能な化学療法剤、ベンズニダゾールおよびニフルティモックスは、有害な副作用を引き起こし、疾患3の慢性相に効果がないため、T.クルジに対する新規な薬物標的を同定することは大きな関心事である。近年、CRISPR/Cas9システムは、GRNAとCas9⁴を含む別個または単一プラスミドのトランスフェクションによって、Cas9およびその後の安定した発現によって、T.クルジで遺伝子ノックアウトを効果的に行う強力なツールとなっています。gRNA 5、6、7またはgRNA8の転写テンプレートの導入、または予形成されたgRNA/Cas9 RNP複合体7、9のエレクトロポレーションによる。この技術の進歩は、シャーガス病の薬物標的研究を加速することが非常に期待されています。

薬剤開発を進めるためには、哺乳類宿主における寄生虫の複製段階であるT.クルジのアマスティゴテにおける標的遺伝子または薬剤候補化合物の有効性を検証することが重要である。しかし、閉塞性宿主細胞が存在するため、アマスティゴットを直接操作することはできないため、これは困難な作業です。リーシュマニアでは、T.クルジに密接に関連する原虫寄生虫、アックスアンスアミゴット培養法が開発され、薬物スクリーニングアッセイ10、11、12、^{および、 13.}アックスアマスティゴテスと細胞内アマスチゴテス14との間の化合物に対する感受性にはいくつかの不一致があるものの、それでもアックス培養を維持する能力は、リーシュマニア15、16の臨床的に関連する段階の基礎生物学。T.クルジの場合、自然発生する細胞外アマスティゴテス(EA)17の存在に関する文献とEA 17、18、19のインビトロ産生何十年も前のことださらに、EAは、トリポスチゴテのそれよりも少ないが、感染^能力20を有することが知られており、近年、アマスティゴット宿主侵入のメカニズムが解明されている(Bonfim-Melo et al.²¹によるレビュー)。しかし、リーシュマニアとは異なり、EAはT.クルジの実験ツールとして利用されていなかった。意味。

最近、我々のグループは、T.クルジのEAを一時的な軸^文化22として利用することを提案した。T.クルシトゥラフエン株のアマスティゴテスは、アマスティゴット様特性の大きな劣化または損失なしに最大10日間、37°CでLIT培地中の宿主細胞を含まない複製が可能です。宿主フリー成長期間中、EAは、従来のエレクトロポレーション、トリパノシダル化合物による薬物滴定アッセイ、およびCRISPR/Cas9媒介ノックアウトに続いて成長表現型モニタリングを行い、外因性遺伝子発現に成功しました。本報告では、インビトロ由来EAを生成し、ノックアウト実験でアックスアンマスタゴテを利用するための詳細なプロトコルについて述べた。