Présentation d'un Knockout Génique Directement dans la phase Amastigote de Trypanosoma cruzi à l'aide du système CRISPR/Cas9
Summary
Ici, nous décrivons un protocole pour introduire un KO de gène dans l’amastigote extracellulaire de Trypanosoma cruzi, utilisant le système CRISPR/Cas9. Le phénotype de croissance peut être suivi soit par le comptage cellulaire de la culture amastigote axenique ou par la prolifération des amastigotes intracellulaires après l’invasion de cellules hôtes.
Abstract
Trypanosoma cruzi est un parasite protozoaire pathogène qui cause la maladie de Chagas principalement en Amérique latine. Afin d’identifier une nouvelle cible médicamentelle contre T. cruzi, il est important de valider l’essentiel du gène cible au stade des mammifères du parasite, l’amastigote. Les amastigotes de T. cruzi se reproduisent à l’intérieur de la cellule hôte; ainsi, il est difficile de mener une expérience knock-out sans passer par d’autres stades de développement. Récemment, notre groupe a signalé une condition de croissance dans laquelle l’amastigote peut se répliquer axenically pendant jusqu’à 10 jours sans perdre ses propriétés amastigote-like. En utilisant cette culture temporelle d’amastigote axenique, nous avons introduit avec succès des gARN directement dans l’amastigote cas9-exprimant pour causer des knockouts de gène et avons analysé leurs phénotypes exclusivement dans le stade d’amastigote. Dans ce rapport, nous décrivons un protocole détaillé pour produire des amastigotes extracellulaires dérivés in vitro, et pour employer la culture axenic dans une expérience de KNOCK-ball CRISPR/Cas9-négociée. Le phénotype de croissance des amastigotes knock-out peut être évalué soit par le nombre de cellules de la culture axenique, soit par la réplication de l’amastigote intracellulaire après l’invasion de cellules hôtes. Cette méthode contourne la différenciation du stade parasite normalement impliquée dans la production d’un amastigote transgénique ou kok. L’utilisation de la culture temporelle de l’amastigote axenique a le potentiel d’élargir la liberté expérimentale des études spécifiques à la scène dans T. cruzi.
Introduction
Trypanosoma cruzi est l’agent causal de la maladie de Chagas, qui est répandue principalement en Amérique latine1. T. cruzi a des stades distinctifs du cycle de vie comme il se déplace entre un insecte vecteur et un hôte de mammifères2. T. cruzi se reproduit comme épimastigote dans le milieu d’un insecte triatomine suceur de sang et se différencie en un trypomastigote métacyclique infectieux dans son intestin postérieur avant d’être déposé sur un hôte humain ou animal. Une fois que le trypomastigote pénètre dans le corps hôte par le site de morsure ou par une muqueuse, le parasite envahit une cellule hôte et se transforme en une forme ronde sans flagella appelée amastigote. L’amastigote se reproduit dans la cellule hôte et finit par se différencier en trypomastigote, qui éclate hors de la cellule hôte et pénètre dans la circulation sanguine pour infecter une autre cellule hôte.
Puisque les agents chimiothérapeutiques actuellement disponibles, le benznidazole et le nifurtimox, causent des effets secondaires défavorables et sont inefficaces dans la phase chronique de la maladie3,il est d’un grand intérêt d’identifier de nouvelles cibles de drogue contre T. cruzi. Ces dernières années, le système CRISPR/Cas9 est devenu un outil puissant pour effectuer efficacement ko en gène dans T. cruzi, soit par transfection de plasmides distincts ou simples contenant gRNA et Cas94, par expression stable de Cas9 et subséquent introduction de gRNA5,6,7 ou modèle de transcription de gRNA8, ou par électroporation du complexe pré-formé gRNA/Cas9 RNP7,9. Cette avancée technologique devrait accélérer la recherche sur les médicaments ciblés dans la maladie de Chagas.
Pour procéder à la mise au point du médicament, il est crucial de valider l’essentiel du gène cible ou l’efficacité des composés candidats médicamenteux dans l’amastigote de T. cruzi, car c’est l’étape de réplication du parasite chez l’hôte mammifère. Cependant, il s’agit d’une tâche difficile, car les amastigotes ne peuvent pas être manipulés directement en raison de la présence d’une cellule hôte obstructive. Dans Leishmania, un parasite protozoaire étroitement lié à T. cruzi, une méthode de culture amastigote axenique a été développé et a été utilisé dans les essais de dépistage de drogues10,11,12, 13. Bien qu’il existe certaines divergences de susceptibilité aux composés entre les amastigotes axeniques et les amastigotes intracellulaires14, la capacité de maintenir la culture axenique fournit néanmoins des outils expérimentaux précieux pour étudier le biologie de base de l’étape cliniquement pertinente de Leishmania15,16. Dans le cas de T. cruzi, les littératures concernant la présence d’amastigotes extracellulaires naturels (EA)17 et la production in vitro d’EA17,18,19 remontent à Décennies. En outre, EA est connu pour avoir une capacité infectieuse20, bien que inférieure à celle de trypomastigote, et le mécanisme de l’invasion hôte amastigote a été élucidé ces dernières années (passé en revue par Bonfim-Melo et al.21 ). Cependant, contrairement à Leishmania, EA n’avait pas été utilisé comme un outil expérimental dans T. cruzi, principalement parce que EA avait été considéré comme un parasite intracellulaire obligatoire, et n’avait donc pas été considéré comme «forme réplicatrice» dans une pratique bon sens.
Récemment, notre groupe a proposé d’utiliser EA de T. cruzi comme culture axenique temporelle22. Les amastigotes de la souche T. cruzi Tulahuen peuvent se répliquer sans cellules hôtes dans le milieu de LIT à 37 oC pendant 10 jours sans détérioration majeure ou perte de propriétés semblables à des amastigotes. Pendant la période de croissance hôte-libre, EA a été avec succès utilisé pour l’expression génique exogène par l’électroporation conventionnelle, essai de titration de drogue avec des composés trypanocidal, et KO CRISPR/Cas9-négocié suivi de la surveillance de phénotype de croissance. Dans ce rapport, nous décrivons le protocole détaillé pour produire l’EE dérivé in vitro et pour employer l’amastigote axenic dans des expériences de knock-out.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons démontré que la culture axenique des amastigotes de T. cruzi peut être utilisée dans LE knock-out de gène CRISPR/Cas9-négocié, en électroporating gRNA directement dans Cas9-exprimant EA. De cette façon, l’essentiel du gène cible spécifiquement au stade amastigote peut être évalué sans passer par d’autres stades de développement.
Un autre aspect bénéfique de la transfection amastigote est la commodité dans l’essai d’un grand nombre de gènes cibles. Une foi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par JSPS KAKENHI Grant Number 18K15141 à Y.T.
Materials
| 20% formalin solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 068-03863 | fixing cells |
| 25 cm2 double seal cap culture flask | AGC Techno Glass | 3100-025 | |
| 75 cm2 double seal cap culture flask | AGC Techno Glass | 3110-075 | |
| All-in One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 | |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for Control) | IDT | custom made | target sequence = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcCGM1) | IDT | custom made | target sequence = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcPAR1) | IDT | custom made | target sequence = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG |
| Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA | IDT | 1072532 | to anneal with crRNA |
| Amaxa Nucleofector device | LONZA | AAN-1001 | electroporation |
| Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | LONZA | VMI-1021 | electroporation |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | component of the medium for in-vitro amastigogenesis |
| Burker-Turk disposable hemocytometer | Watson | 177-212C | cell counting |
| Coster 12-well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3513 | |
| DMEM | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 044-29765 | culture medium |
| Fetal bovine serum, Defined | Hyclone | SH30070.03 | heat-inactivate before use |
| G-418 Sulfate Solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 077-06433 | selection of transformant |
| Hemin chloride | Sigma-Aldrich | H-5533 | component of LIT medium |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | staining of nuclei |
| Liver infusion broth, Difco | Becton Dickinson | 226920 | component of LIT medium |
| MES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 349-01623 | component of the medium for in-vitro amastigogenesis |
| PBS (–) | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 166-23555 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | staining of dead cells |
| RPMI 1646 | Sigma-Aldrich | R8758 | medium for metacyclogenesis |
References
- World Health Organization. . (WHO) Fact sheet: Chagas disease (American trypanosomiasis). , (2017).
- Clayton, J. Chagas disease 101. Nature. 465 (n7301_supp), S4-S5 (2010).
- Apt, W. Current and developing therapeutic agents in the treatment of Chagas disease. Drug Design, Development and Therapy. 4, 243-253 (2010).
- Lander, N., Li, Z. H. H., Niyogi, S., Docampo, R. CRISPR/Cas9-induced disruption of paraflagellar rod protein 1 and 2 genes in Trypanosoma cruzi reveals their role in flagellar attachment. mBio. 6 (4), e01012 (2015).
- Peng, D., Kurup, S. P., Yao, P. Y., Minning, T. A., Tarleton, R. L. CRISPR-Cas9-mediated single-gene and gene family disruption in Trypanosoma cruzi. mBio. 6 (1), e02097-e02114 (2015).
- Romagnoli, B. A. A., Picchi, G. F. A., Hiraiwa, P. M., Borges, B. S., Alves, L. R., Goldenberg, S. Improvements in the CRISPR/Cas9 system for high efficiency gene disruption in Trypanosoma cruzi. Acta Tropica. 178, 190-195 (2018).
- Burle-Caldas, G. A., Soares-Simões, M., Lemos-Pechnicki, L., DaRocha, W. D., Teixeira, S. M. R. Assessment of two CRISPR-Cas9 genome editing protocols for rapid generation of Trypanosoma cruzi gene knockout mutants. International Journal for Parasitology. 48 (8), 591-596 (2018).
- Costa, F. C. Expanding the toolbox for Trypanosoma cruzi: A parasite line incorporating a bioluminescence-fluorescence dual reporter and streamlined CRISPR/Cas9 functionality for rapid in vivo localisation and phenotyping. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (4), e0006388 (2018).
- Soares Medeiros, L. C. High-Efficiency Genome Editing in Protozoan Parasites Using CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins. mBio. 8 (6), (2017).
- Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. An axenic amastigote system for drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (4), 818-822 (1997).
- Bates, P. A. Axenic culture of Leishmania amastigotes. Parasitology Today. 9 (4), 143-146 (1993).
- Ravinder, R., Bhaskar, B., Gangwar, S., Goyal, N. Development of luciferase expressing Leishmania donovani axenic amastigotes as primary model for in vitro screening of antileishmanial compounds. Current Microbiology. 65 (6), 696-700 (2012).
- Nühs, A. Development and Validation of a Novel Leishmania donovani Screening Cascade for High-Throughput Screening Using a Novel Axenic Assay with High Predictivity of Leishmanicidal Intracellular Activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), 1-17 (2015).
- De Rycker, M. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
- Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
- Pescher, P., Blisnick, T., Bastin, P., Späth, G. F. Quantitative proteome profiling informs on phenotypic traits that adapt Leishmania donovani for axenic and intracellular proliferation. Cellular Microbiology. 13 (7), 978-991 (2011).
- Andrews, N. W., Hong, K. S. U., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. Stage-specific surface antigens expressed during the morphogenesis of vertebrate forms of Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology. 64 (3), 474-484 (1987).
- Pan, S. C. Trypanosoma cruzi: intracellular stages grown in a cell-free medium at 37 C. Experimental Parasitology. 45 (2), 215-224 (1978).
- Tomlinson, S., Vandekerckhove, F., Frevert, U., Nussenzweig, V. The induction of Trypanosoma cruzi trypomastigote to amastigote transformation by low pH. Parasitology. 110 (05), 547 (1995).
- Ley, V., Andrews, N. W., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. Amastigotes of Trypanosoma cruzi sustain an infective cycle in mammalian cells. Journal of Experimental Medicine. 168 (0022-1007 (Print)), 649-659 (1988).
- Bonfim-Melo, A., Ferreira, E. R., Florentino, P. T. V., Mortara, R. A. Amastigote Synapse: The Tricks of Trypanosoma cruzi Extracellular Amastigotes. Frontiers in Microbiology. 9, 1341 (2018).
- Takagi, Y., Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K. Utilization of proliferable extracellular amastigotes for transient gene expression, drug sensitivity assay, and CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in Trypanosoma cruzi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 13 (1), e0007088 (2019).
- Fernandes, J. F., Castellani, O. Growth characteristics and chemical composition of Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology. 18 (2), 195-202 (1966).
- Oberholzer, M., Lopez, M. A., Ralston, K. S., Hill, K. L. Approaches for Functional Analysis of Flagellar Proteins in African Trypanosomes. Methods in Cell Biology. 93, 21-57 (2009).
- van den Hoff, M. J. B., Moorman, A. F. M., Lamers, W. H. Electroporation in ‘intracellular’ buffer increases cell survival. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2902-2902 (1992).
- Pacheco-Lugo, L., Díaz-Olmos, Y., Sáenz-García, J., Probst, C. M., DaRocha, W. D. Effective gene delivery to Trypanosoma cruzi epimastigotes through nucleofection. Parasitology International. 66 (3), 236-239 (2017).
- Coughlin, B. C., Teixeira, S. M., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Amastin mRNA abundance in Trypanosoma cruzi is controlled by a 3’-untranslated region position-dependent cis-element and an untranslated region-binding protein. The Journal of Biological Chemistry. 275 (16), 12051-1260 (2000).
- Shaw, A. K., Kalem, M. C., Zimmer, S. L. Mitochondrial Gene Expression Is Responsive to Starvation Stress and Developmental Transition in Trypanosoma cruzi. mSphere. 1 (2), (2016).
- Chao, D., Dusanic, D. G. Comparative studies of the isolation of metacyclic trypomastigotes of Trypanosoma cruzi by DEAE ion exchange chromatography. Zhonghua Minguo wei sheng wu ji mian yi xue za zhi (Chinese Journal of Microbiology and Immunology). 17 (3), 146-152 (1984).
- Nogueira, N., Bianco, C., Cohn, Z. Studies on the selective lysis and purification of Trypanosoma cruzi. The Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 224-229 (1975).
- Minning, T. A., Weatherly, D. B., Atwood, J., Orlando, R., Tarleton, R. L., Tarleton, R. L. The steady-state transcriptome of the four major life-cycle stages of Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 10, 370 (2009).
- Rico, E., Jeacock, L., Kovářová, J., Horn, D. Inducible high-efficiency CRISPR-Cas9-targeted gene editing and precision base editing in African trypanosomes. Scientific Reports. 8 (1), 7960 (2018).
- Fu, Y. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Chiurillo, M. A., Lander, N., Bertolini, M. S., Storey, M., Vercesi, A. E., Docampo, R. Different roles of mitochondrial calcium uniporter complex subunits in growth and infectivity of Trypanosoma cruzi. mBio. 8 (3), e00574-e00617 (2017).
