Evaluación del Estado de Fertilización mediante el seguimiento de la morfología nuclear de los espermatozoides en la doble fertilización de Arabidopsis

Las plantas con flores producen semillas a través de la doble fertilización, un proceso que se controla directamente mediante interacciones entre proteínas localizadas en la membrana plasmática gameto^1,2. La floración de los gametos masculinos de las plantas, un par de espermatozoides, se desarrollan en el polen. Un tubo de polen que crece después de la polinización entrega un par de espermatozoides a gametos femeninos, una célula de óvulo y una célula central, que se desarrollan en un saco embrionario. Después de que los gametos masculinos y femeninos se encuentran, las proteínas en la superficie del gameto promueven el reconocimiento, el apego y la fusión para completar la doble fertilización. En estudios anteriores, las proteínas de membrana de gameto masculino GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)^3,4 y GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)⁵ se identificaron como reguladores de fertilización involucrados en la fusión de gametos y adjunto, respectivamente. Recientemente identificamos una proteína de membrana específica del gameto masculino, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), como un regulador de fertilización involucrado en la interacción de gametos. Encontramos que una disminución de la expresión DMP9 resulta en una inhibición significativa de la fertilización de células de óvulo sin efecto durante la fertilización doble en A. thaliana⁶.

Como la fertilización doble se produce en un saco embrionario, que está incrustado en un óvulo que se envuelve aún más con tejido ovárizado, es difícil observar y analizar los estados de los procesos de fertilización doble. Por esta razón, todavía hay muchos puntos poco claros que dificultan una comprensión completa de todo el mecanismo de control de doble fertilización. El establecimiento de técnicas de observación para rastrear el comportamiento de los gametos durante la doble fertilización en condiciones in vivo es indispensable para el análisis funcional de los posibles candidatos para los reguladores de fertilización. Estudios recientes han dado lugar a líneas de marcadores donde las estructuras subcelulares gameto están etiquetadas con proteínas fluorescentes. En este artículo, demostramos un protocolo simple y rápido para observar la doble fertilización que se ha producido en un saco embrionario derivado de pistilos polinizados artificialmente. Utilizando la línea de marcador de núcleo de células espermáticas HTR10-mRFP⁷, el estado de fertilización de cada gameto femenino puede ser discriminado sobre la base de la morfología de la señal nuclear de espermatozoides. Nuestro protocolo centrado en tal cambio morfológico de los núcleos espermáticos en la fertilización puede obtener eficientemente una cantidad suficiente de datos para la prueba estadística. Se utilizó una línea de derribo DMP9con fondo HTR10-mRFP (DMP9^{KD/HTR10-mRFP}) como plantas masculinas para mostrar un único patrón de fertilización. El protocolo también es adecuado para el análisis funcional de otros reguladores de fertilización.