Evaluatie van de bemesting staat door het traceren van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting
Summary
We demonstreren een methode om de succesvolle of mislukte bevruchting te bepalen op basis van de sperma nucleaire morfologie in Arabidopsis dubbele bevruchting met behulp van een epifluorescentie Microscoop.
Abstract
Bloeiende planten hebben een uniek seksueel reproductie systeem dat ‘ dubbele bevruchting ‘ wordt genoemd, waarbij elk van de spermacellen nauwkeurig met een eicel of een centrale cel smelt. Zo vinden er bijna gelijktijdig twee onafhankelijke bevruchting gebeurtenissen plaats. De bevruchte eicel en de centrale cel ontwikkelen respectievelijk zygote en endosperm. Daarom is nauwkeurige controle van dubbele bevruchting essentieel voor de daaruit voortvloeiende ontwikkeling van zaaizaad. Dubbele bemesting treedt op in de vrouwelijke gametofyt (embryo SAC), die diep verborgen is en bedekt is met dikke ovalen en Eier weefsels. Deze stamper weefsel constructie maakt observatie en analyse van dubbele bevruchting heel moeilijk en heeft de huidige situatie gecreëerd waarin veel vragen over het mechanisme van dubbele bevruchting onbeantwoord blijven. Voor de functionele evaluatie van een potentiële kandidaat voor bevruchting regulator is fenotypische analyse van bemesting belangrijk. Om te oordelen over de voltooiing van de bevruchting in Arabidopsis thaliana, de vormen van fluorescentie signalen labelen van sperma kernen worden gebruikt als indicatoren. Een zaadcel die niet bevruchten wordt, wordt aangegeven door een gecondenseerd fluorescentie signaal buiten de vrouwelijke gameten, terwijl een zaadcel die met succes bemesten wordt aangegeven door een gedegecondenseerd signaal als gevolg van karyogamie met de Nucleus van de vrouwelijke gameten. De hier beschreven methode biedt een hulpmiddel om de succesvolle of mislukte bevruchting onder in vivo condities te bepalen.
Introduction
Bloeiende planten produceren zaden door dubbele bevruchting, een proces dat rechtstreeks wordt beheerst door interacties tussen eiwitten gelokaliseerd op gameten plasma membraan1,2. Bloeiende plant mannelijke gameten, een paar spermacellen, Ontwikkelen in pollen. Een pollen buis die groeit na bestuiving levert een paar spermacellen aan vrouwelijke gameten, een eicel en een centrale cel, die in een embryo-zak ontwikkelen. Nadat de mannelijke en vrouwelijke gameten elkaar ontmoeten, bevorderen eiwitten op het gameten-oppervlak herkenning, gehechtheid en fusie om dubbele bevruchting te voltooien. In eerdere studies werden de mannelijke gameten membraan eiwitten generatieve celspecifieke 1 (GCS1)/hapless2 (HAP2)3,4 en gameten uitgedrukt 2 (GEX2)5 geïdentificeerd als bevruchting regulatoren die betrokken zijn bij gameten fusie en bijlage, respectievelijk. Onlangs identificeerden we een mannelijk gameten-specifiek membraan proteïne, DUF679 DOMAIN membraan PROTEIN 9 (DMP9), als een bemesting regulator die betrokken is bij gameten interactie. We constateerden dat een afname van DMP9 expressie resulteert in significante remming van de bemesting van eicellen tijdens dubbele bevruchting in a. thaliana6.
Aangezien dubbele bevruchting optreedt in een embryo-zak, die is ingebed in een eicel die verder is verpakt met ovariumweefsel, is het moeilijk om de toestanden van dubbele bevruchting processen te observeren en te analyseren. Om deze reden zijn er nog steeds veel onduidelijke punten die een volledig begrip van het hele mechanisme van dubbele bevruchting controle belemmeren. De vaststelling van observatie technieken om het gedrag van gameten te traceren tijdens dubbele bevruchting onder in vivo omstandigheden is onmisbaar voor de functionele analyse van potentiële kandidaten voor bemesting regulatoren. Recente studies hebben markeringslijnen opgeleverd waar gameten subcellulaire structuren gelabeld zijn met fluorescerende eiwitten. In dit artikel tonen we een eenvoudig en snel protocol voor het observeren van dubbele bevruchting die heeft plaatsgevonden in een embryo-zak die is afgeleid van kunstmatig bestuikte stampers. Met behulp van sperma Cell Nucleus marker lijn HTR10-mRFP7, de bevruchting staat van elke vrouwelijke gameten kan worden gediscrimineerd op basis van sperma nucleaire signaal morfologie. Ons protocol gericht op een dergelijke morfologische verandering van de sperma kernen bij bevruchting kan efficiënt een voldoende hoeveelheid gegevens verkrijgen voor statistisch bewijs. Een DMP9-knockdown lijn met HTR10-mrfp achtergrond (DMP9KD/HTR10-mrfp) werd gebruikt als mannelijke planten om een enkele bevruchting patroon tonen. Het protocol is ook geschikt voor de functionele analyse van andere bemesting regulatoren.
Protocol
Representative Results
Discussion
HTR10-mrfp labels vaderlijke chromatine (dat wil zeggen, visualiseert sperma celkernen), en de dynamiek in dubbele bevruchting is gemeld7. Onmiddellijk na het vrijkomen van een stuifmeel buis, HTR10-mRFP-gelabelde sperma kernen zijn nog steeds gecondenseerd. Echter, elk van de zaad kernen is gedegecondenseerd bij het samenvoegen met een bevruchte vrouwelijke gameten Nucleus op karyogamie drie tot vier uur na gameten membraan fusie7. Onbevruchte spermacellen blijven geconden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Japan Society voor de promotie van Science KAKENHI Grant (JP17H05832 to T. I.) en door financiering van het strategisch prioriteits onderzoek promotieprogramma voor fytochemische planten moleculaire wetenschappen, Universiteit van Chiba (Japan).
Materials
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
||
| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
||
| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 gauge |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA0.75), dry |
References
- Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. Gamete dialogs in green lineages. Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Current Biology. 26, R125-R139 (2016).
- Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
- von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
- Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
- Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076 (2018).
- Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690 (2013).
- Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
- Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).
