تقييم حالة الإخصاب من خلال تتبع المورفولوجيا النووية للنطفو النووي للنطفو في الإخصاب المزدوج في أرابيدوبوسيس
Summary
نحن نبرهن على طريقة لتحديد الإخصاب الناجح أو الفاشل على أساس مورفولوجيا الحيوانات المنوية النووية في الإخصاب المزدوج في أرابيدوبسيس باستخدام مجهر الظهارة.
Abstract
النباتات المزهرة لديها نظام استنساخ جنسي فريد يسمى “الإخصاب المزدوج”، حيث كل من خلايا الحيوانات المنوية الصمامات على وجه التحديد مع خلية البيض أو خلية مركزية. وهكذا، يحدث حدثان مستقلان للإخصاب في وقت واحد تقريبا. تتطور خلية البويضة المخصبة والخلية المركزية إلى الزيجوت والحيوانات المنوية، على التوالي. ولذلك، فإن السيطرة الدقيقة على الإخصاب المزدوج أمر ضروري لتطوير البذور الناجمة عن ذلك. يحدث الإخصاب المزدوج في اللجامفيت الإناث (كيس الجنين)، والتي هي مخبأة بعمق ومغطاة بأنسجة البويضة والمبيض سميكة. هذا البناء الأنسجة pistil يجعل مراقبة وتحليل الإخصاب المزدوج من الصعب جدا، وخلق الوضع الحالي الذي العديد من الأسئلة المتعلقة بآلية الإخصاب المزدوج لا تزال دون إجابة. وللتقييم الوظيفي لمرشح محتمل لتنظيم الإخصاب، من المهم إجراء تحليل للإخصاب. للحكم على الانتهاء من الإخصاب في التلاحيّة العربية، تُستخدم أشكال إشارات الفلورة التي تصف نوى الحيوانات المنوية كمؤشرات. يشار إلى خلية الحيوانات المنوية التي تفشل في الإخصاب بإشارة الفلورة المكثفة خارج اللجام الإناث، في حين أن خلية الحيوانات المنوية التي يتم إخصابها بنجاح يشار إليها بإشارة منزوعة المكثف بسبب karyogamy مع نواة اللجام الإناث. توفر الطريقة الموضحة هنا أداة لتحديد الإخصاب الناجح أو الفاشل في ظروف الجسم الحي.
Introduction
النباتات المزهرة تنتج البذور من خلال الإخصاب المزدوج، وهي عملية يتم التحكم فيها مباشرة من خلال التفاعلات بين البروتينات المترجمة على غشاء البلازما gamete1،2. المزهرة نبات الذكور gametes، زوج من خلايا الحيوانات المنوية، وتطوير في حبوب اللقاح. أنبوب حبوب اللقاح الذي ينمو بعد التلقيح يسلم زوج من خلايا الحيوانات المنوية إلى اللجام الإناث، وخلية البيض والخلية المركزية، والتي تتطور في كيس الجنين. بعد أن يجتمع المدرس الذكور والإناث، والبروتينات على سطح gamete تعزيز الاعتراف، والتعلق، والانصهار لاستكمال الإخصاب المزدوج. في الدراسات السابقة، تم تحديد البروتينات غشاء الجاميت الذكور الخلية المولدةمحددة 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2) 3،4 وGAMETE أعرب 2 (GEX2)5 كمنظمي الإخصاب المشاركة في اندماج gamete و المرفق، على التوالي. لقد حددنا مؤخرًا بروتين غشاء خاص بـ gamete للذكور، DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9)، كمنظم للإخصاب يشارك في تفاعل gamete. وجدنا أن انخفاض التعبير DMP9 يؤدي إلى تثبيط كبير من تخصيب خلايا البيض خلال الإخصاب المزدوج في A. thaliana6.
كما يحدث الإخصاب المزدوج في كيس الجنين، الذي هو جزء لا يتجزأ من البويضة التي هي ملفوفة أكثر مع أنسجة المبيض، فمن الصعب مراقبة وتحليل حالات عمليات الإخصاب المزدوج. ولهذا السبب، لا تزال هناك العديد من النقاط غير الواضحة التي تعوق الفهم الكامل للآلية الكاملة لمراقبة الإخصاب المزدوج. إن إنشاء تقنيات مراقبة لتتبع سلوك الغمت أثناء الإخصاب المزدوج في ظل ظروف الجسم الحي أمر لا غنى عنه للتحليل الوظيفي للمرشحين المحتملين لمنظمي الإخصاب. وقد أسفرت الدراسات الحديثة خطوط علامة حيث يتم تسمية الهياكل دون الخلوية gamete مع البروتينات الفلورية. في هذه المقالة، نقوم بإظهار بروتوكول بسيط وسريع لمراقبة الإخصاب المزدوج الذي حدث في كيس جنين مشتق من البتيلات الملقحة بشكل مصطنع. باستخدام خط علامة نواة خلية الحيوانات المنوية HTR10-mRFP7، يمكن التمييز بين حالة الإخصاب لكل غمت أنثى على أساس مورفولوجيا الإشارات النووية للنطفو. بروتوكولنا الذي يركز على مثل هذا التغيير المورفولوجي لنوى الحيوانات المنوية عند الإخصاب يمكن أن يحصل بكفاءة على كمية كافية من البيانات لإثبات الإحصائية. تم استخدام خط DMP9-الضربة القاضية مع خلفية HTR10-mRFP(DMP9KD/HTR10-mRFP)كنباتات ذكرية لإظهار نمط تخصيب واحد. كما أن البروتوكول مناسب للتحليل الوظيفي لمنظمي الإخصاب الآخرين.
Protocol
Representative Results
Discussion
HTR10-mRFP تسميات الكروماتين الأبوي (أي، تصور نوى خلايا الحيوانات المنوية)، وقد تم الإبلاغ عن ديناميات في الإخصاب المزدوج7. مباشرة بعد الإفراج عن أنبوب حبوب اللقاح، لا تزال تتكثف نواة الحيوانات المنوية HTR10-mRFP المسمى. ومع ذلك، يتم إزالة المكثفات كل من نوى الحيوانات المنوية عند الان?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل منحة كاكينجي المقدمة من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JP17H05832 إلى T.I.) وبتمويل من برنامج تعزيز البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية للعلوم الجزيئية النباتية الكيميائية، جامعة شيبا (اليابان).
Materials
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
||
| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
||
| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 gauge |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA0.75), dry |
References
- Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. Gamete dialogs in green lineages. Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Current Biology. 26, R125-R139 (2016).
- Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
- von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
- Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
- Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076 (2018).
- Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690 (2013).
- Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
- Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).
