通过追踪阿拉伯植物双重受精中的精子核形态对受精国的评价
Summary
我们演示了一种利用荧光显微镜在阿拉伯拟南芥中精子核形态测定成功或失败受精的方法。
Abstract
开花植物有一个独特的性生殖系统，称为”双受精”，其中每个精子细胞精确与卵细胞或中心细胞融合。因此，两个独立的受精事件几乎同时发生。受精卵细胞和中枢细胞分别发育成酶和内膜。因此，精确控制双施肥对后续种子发育至关重要。双重受精发生在雌性野味（胚胎囊），这是深隐藏，覆盖着厚厚的卵巢和卵巢组织。这种双倍施肥的构造使得对双施肥的观察和分析相当困难，造成了目前双施肥机制问题仍未解决的局面。对于施肥调节器潜在候选者的功能评估，施肥的体称分析非常重要。为了判断在阿拉伯拟南芥中受精的完成情况，用标记精子核的荧光信号的形状作为指标。未能受精的精子细胞由雌性配子外的凝聚荧光信号指示，而成功受精的精子细胞则通过与雌性配子核的结核核的减压信号表示。此处描述的方法提供了一个工具，用于确定在体内条件下成功或失败的受精。
Introduction
开花植物通过双重受精产生种子，这个过程由在Gamete血浆膜1、2上局部的蛋白质之间的相互作用直接控制。开花植物雄性配子，一对精子细胞，在花粉中发育。授粉后生长的花粉管将一对精子细胞输送到雌性配子、卵细胞和中心细胞，这些细胞在胚胎囊中发育。雄性配子和雌性配子相遇后，配子表面的蛋白质促进识别、附着和融合，以完成双重受精。在以前的研究中，雄性Gamete膜蛋白：2（GCS1）/HAPLESS2（HAP2）3、4和GAMETE表达2（GEX2）5被确定为参与Gamete融合的受精调节剂，附件。我们最近鉴定出一种雄性gamete特异性膜蛋白，DUF679 DOMAIN，第9蛋白（DMP9），作为参与Gamete相互作用的受精调节剂。我们发现，DMP9表达的减少导致在A.thaliana6的双重受精期间对卵细胞受精的显著抑制。
由于双受精发生在胚胎囊中，胚胎囊嵌入在卵巢组织进一步包裹的卵子中，因此很难观察和分析双重受精过程状态。因此，仍有许多不明确的点，阻碍对双施肥控制的整体机制的全面了解。建立观察技术，以跟踪在体内条件下的双重受精过程中配子的行为，对于对施肥调节器的潜在候选物进行功能分析是必不可少的。最近的研究已经产生了标记线，其中Gamete亚细胞结构被标记与荧光蛋白。在本文中，我们演示了一种简单而快速的协议，用于观察从人工授粉的皮斯蒂尔衍生的胚胎囊中发生的双重受精。使用精子细胞核标记线HTR10-mRFP7，每个雌性胶合物的受精状态可以基于精子核信号形态进行区分。我们的方案侧重于精子核在受精时的变化，可以有效地获得足够的数据进行统计证明。具有HTR10-mRFP背景（DMP9 KD/HTR10-mRFP）的DMP9-敲落线用作雄性植物，以显示单一施肥模式。该协议也适用于其他施肥调节器的功能分析。
Protocol
Representative Results
Discussion
HTR10-mRFP标签父色素（即，可视化精子细胞核），和动态在双受精已报告7。从花粉管中释放后，HTR10-mRFP标记的精子核仍然凝结。然而，每个精子核在与受精的雌性体细胞核合并后，在Gamete膜融合7后三到四个小时被解压缩。未受精的精子细胞保持浓缩，如在胚胎囊中所示，在胚胎囊中gcs1精子细胞在没有受精的情况下被吸收（图3D）。…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了日本科学促进协会KAKENHI赠款（JP17H05832至T.I.）的支持，以及日本千叶大学植物化学植物分子科学战略优先研究促进方案的资助。
Materials
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
||
| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
||
| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 gauge |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA0.75), dry |
References
- Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. Gamete dialogs in green lineages. Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Current Biology. 26, R125-R139 (2016).
- Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
- von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
- Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
- Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076 (2018).
- Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690 (2013).
- Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
- Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).
