Summary

Avaliação do estado de fertilização por rastreamento da morfologia nuclear de espermatozóides na adubação dupla de Arabidopsis

Published: August 29, 2019
doi:

Summary

Nós demonstramos um método para determinar a fecundação bem sucedida ou falhada com base na morfologia nuclear do esperma na fertilização dobro de Arabidopsis usando um microscópio da epifluorescência.

Abstract

As plantas de florescência têm um sistema sexual original da reprodução chamado ‘ fertilização dobro ‘, em que cada um das pilhas do sperm funde precisamente com uma pilha de ovo ou uma pilha central. Assim, dois eventos de fertilização independente acontecem quase que simultaneamente. A pilha de ovo fertilizada e a pilha central tornam-se no zigoto e no endosperm, respectivamente. Portanto, o controle preciso da dupla adubação é essencial para o desenvolvimento de sementes que se seguiu. A fertilização dupla ocorre no gametófito fêmea (saco do embrião), que é profundamente escondida e coberta com os tecidos grossos do óvulo e do ovário. Esta construção do tecido do pistilo faz a observação e a análise da fertilização dobro completamente difícil e criou a situação atual em que muitas perguntas a respeito do mecanismo da fertilização dobro permanecem sem resposta. Para a avaliação funcional de um candidato potencial para o regulador da fertilização, a análise fenotípica da fertilização é importante. Para julgar a conclusão da fertilização em Arabidopsis Arabidopsis thaliana, as formas de sinais de fluorescência rotulando núcleos de espermatozóides são usadas como indicadores. Uma célula espermática que não fertilizar é indicada por um sinal de fluorescência condensado fora das gametas femininas, enquanto uma célula espermática que fertiliza com sucesso é indicada por um sinal desnaturado devido à carigamia com o núcleo feminino dos gametas. O método descrito aqui fornece uma ferramenta para determinar a fertilização bem-sucedida ou fracassada em condições in vivo.

Introduction

Plantas floridas produzem sementes através de dupla adubação, um processo que é controlado diretamente por interações entre proteínas localizadas na membrana plasmáticadegameta 1,2. Os gametas masculinos da planta de florescência, um par de pilhas de esperma, desenvolvem-se no pólen. Um tubo de pólen que cresce após a polinização entrega um par de células espermáticas para gametas femininas, uma célula de ovo e uma célula central, que se desenvolvem em um saco embrionário. Depois que os gametas masculinos e femininos se encontram, as proteínas na superfície do gameta promovem o reconhecimento, o acessório, e a fusão para terminar a fertilização dobro. Em estudos prévios, as proteínas da membrana do gameta masculino Generative Cell SPECIFIC 1 (GCS1)/hapless2 (HAP2)3,4e gameta expressadas 2 (GEX2)5 foram identificadas como reguladores de fertilização envolvidos na fusão de gametas e acessório, respectivamente. Nós identificamos recentemente uma proteína gameta-específica masculina da membrana, proteína 9 da membrana do domínio DUF679 (DMP9), como um regulador da fertilização envolvido na interação do gameta. Verificou-se que uma diminuição da expressão de DMP9 resulta em inibição significativa da adubação de células de ovo durante a dupla adubação em a. Arabidopsis thaliana6.

Como a fertilização dupla ocorre em um saco embrionário, que é incorporado em um óvulo que é mais envolvido com o tecido do ovário, é difícil observar e analisar os Estados de processos de fertilização dupla. Por esta razão, ainda há muitos pontos obscuros que impedem uma compreensão completa de todo o mecanismo de controle de fertilização dupla. O estabelecimento de técnicas de observação para traçar o comportamento dos gâmetas durante a dupla adubação condições in vivo é indispensável para a análise funcional de potenciais candidatos a reguladores de fertilização. Estudos recentes produziram linhas de marcador onde as estruturas subcelulares do gameta são rotuladas com proteínas fluorescentes. Neste artigo, demonstramos um protocolo simples e rápido para observar a dupla adubação que ocorreu em um saco embrionário derivado de pistilos artificialmente polinados. Usando a linha do marcador do núcleo da célula espermática HTR10-MRFP7, o estado da fertilização de cada gameta fêmea pode ser discriminado com base na morfologia nuclear do sinal do esperma. Nosso protocolo focalizando em tal mudança morfológica dos núcleos do esperma na fertilização pode eficientemente obter uma quantidade suficiente de dados para a prova estatística. Uma linha DMP9-knockdown com fundo HTR10-MRFP (DMP9KD/HTR10-MRFP) foi usada como plantas masculinas para mostrar um único teste padrão da fecundação. O protocolo também é adequado para a análise funcional de outros reguladores de fertilização.

Protocol

1. polinização artificial Nota: Antes de iniciar o processo, é necessário um par de fórceps n º 5. Cresça a. Arabidopsis thaliana (Col-0) em 22 ° c um ciclo escuro de 16-h Light/8-h em uma câmara de crescimento.Nota: Corte e remova a primeira haste desenvolvida da flor com as tesouras para promover o desenvolvimento de botões axilar. As plantas vigorously crescentes (2-3 semanas após o corte da primeira haste; a altura da plan…

Representative Results

Ovules de um pistilo polinizadas com DMP9KD/HTR10-MRFP foram coletados em 7-8 HAP e observados. A maioria dos óvulos continha dois núcleos de espermatozóides desnaturados com mRFP na célula do ovo (lado micropylar) e as posições do núcleo da célula central (lado final do charazal), respectivamente (Figura 3a), indicando dupla fertilização bem-sucedida. Além disso, for…

Discussion

HTR10-mRFP rotula a cromatina paterna (isto é, visualiza núcleos de células espermáticas), e a dinâmica na fertilização dupla foi relatada7. Imediatamente após a liberação de um tubo de pólen, HTR10-mRFP-rotulado núcleos de esperma ainda são condensados. Entretanto, cada um dos núcleos do esperma é desdensed em cima da fusão com um núcleo fêmea fertilizado do gameta em karyogamy três a quatro horas após a fusão7da membrana do gameta. As células de espe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela sociedade japonesa para a promoção da ciência KAKENHI Grant (JP17H05832 to T. I.) e pelo financiamento do programa de promoção estratégica de pesquisa prioritária em fitoquímica Plant Molecular Sciences, Chiba University (Japão).

Materials

BX51 Olympus Epifluorescence microscope
Cover glass Matsunami glass C018181
DMP9KD/HTR10-mRFP Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background
Takahashi et al. (2018)6
Double-sided tape Nichiban NW-15S 15 mm width
DP72 Olympus Degital camera
Forceps Vigor Any No. 5 forceps are available
Growth chamber Nihonika LPH-411PFQDT-SP
HTR10-mRFP Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background
Ingouff et al. (2007)7
Injection needle Terumo NN-2719S 27 gauge
Slide glass Matsunami glass S9443
SZX9 Olympus Dissecting microscope
U-MRFPHQ Olympus Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565)
UPlanFL N 40x Olympus Objective lens (NA 1.3), oil-immersion
UPlanSApo 20x Olympus Objective lens (NA0.75), dry

References

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Cite This Article
Takahashi, T., Igawa, T. Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization. J. Vis. Exp. (150), e59916, doi:10.3791/59916 (2019).

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