Bewertung des Düngezustands durch Rückverfolgung der Sperma-Kernmorphologie in Arabidopsis Doppeldüngung
Summary
Wir zeigen eine Methode zur Bestimmung einer erfolgreichen oder fehlgeschlagenen Befruchtung auf Basis der Spermien-Kernmorphologie in Arabidopsis Doppelbefruchtung mit einem Epifluoreszenzmikroskop.
Abstract
Blühende Pflanzen haben ein einzigartiges sexuelles Reproduktionssystem namens “Doppelte Befruchtung”, in dem jede der Spermien präzise mit einer Eizelle oder einer zentralen Zelle verschmilzt. So finden fast gleichzeitig zwei unabhängige Düngeereignisse statt. Die befruchtete Eizelle und die Zentralzelle entwickeln sich zu Zygoten bzw. Endospermen. Daher ist eine präzise Kontrolle der Doppeldüngung für die anschließende Saatgutentwicklung unerlässlich. Die doppelte Befruchtung erfolgt im weiblichen Gametophyten (Embryosack), der tief versteckt und mit dicken Eizellen und Eierstockgeweben bedeckt ist. Diese Stempelgewebekonstruktion erschwert die Beobachtung und Analyse der Doppeldüngung und hat die gegenwärtige Situation geschaffen, in der viele Fragen zum Mechanismus der Doppeldüngung unbeantwortet bleiben. Für die funktionelle Bewertung eines potenziellen Kandidaten für die Düngungsregulierer ist eine phänotypische Analyse der Befruchtung wichtig. Um den Abschluss der Befruchtung in Arabidopsis thalianazu beurteilen, werden die Formen von Fluoreszenzsignalen, die Spermienkerne kennzeichnen, als Indikatoren verwendet. Eine Spermienzelle, die nicht befruchtet, wird durch ein kondensiertes Fluoreszenzsignal außerhalb der weiblichen Gameten angezeigt, während eine Spermienzelle, die erfolgreich befruchtet, durch ein dekondensiertes Signal aufgrund von Karyogamie mit dem Weiblichen Gametenkern angezeigt wird. Die hier beschriebene Methode stellt ein Werkzeug zur Bestimmung einer erfolgreichen oder fehlgeschlagenen Befruchtung unter in vivo-Bedingungen dar.
Introduction
Blühende Pflanzen produzieren Samen durch doppelte Befruchtung, ein Prozess, der direkt durch Wechselwirkungen zwischen Proteinen gesteuert wird, die auf Gamete Plasmamembran1,2lokalisiert sind. Blühende Pflanzenmännchen gameten, ein Paar Spermien, entwickeln sich in Pollen. Ein Pollenrohr, das nach der Bestäubung wächst, liefert ein Paar Spermien an weibliche Gameten, eine Eizelle und eine zentrale Zelle, die sich in einem Embryosack entwickeln. Nachdem sich die männlichen und weiblichen Gameten treffen, fördern Proteine auf der Gamete-Oberfläche Die Erkennung, Anhaftung und Fusion, um eine doppelte Befruchtung zu vollenden. In früheren Studien wurden die männlichen Gamete-Membranproteine GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)3,4 und GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 als Befruchtungsregulatoren identifiziert, die an der Gamete-Fusion und Anlage. Kürzlich haben wir ein männliches Gamete-spezifisches Membranprotein, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), als Düngeregulator identifiziert, der an der Gamete-Interaktion beteiligt ist. Wir fanden heraus, dass eine Abnahme der DMP9-Expression zu einer signifikanten Hemmung der Befruchtung von Eizellen während der Doppelbefruchtung in A. thaliana6führt.
Da die Doppelbefruchtung in einem Embryosack auftritt, der in eine Eizelle eingebettet ist, die weiter mit Eierstockgewebe umwickelt ist, ist es schwierig, die Zustände von Doppelbefruchtungsprozessen zu beobachten und zu analysieren. Aus diesem Grund gibt es noch viele unklare Punkte, die ein vollständiges Verständnis des gesamten Mechanismus der doppelten Düngungskontrolle behindern. Die Etablierung von Beobachtungstechniken zur Verfolgung des Verhaltens von Gameten während der Doppelten Befruchtung unter in vivo-Bedingungen ist für die funktionelle Analyse potenzieller Kandidaten für Diebesregulatoren unerlässlich. Jüngste Studien haben Markerlinien ergeben, in denen subzelluläre Strukturen von Gamete mit fluoreszierenden Proteinen gekennzeichnet sind. In diesem Artikel zeigen wir ein einfaches und schnelles Protokoll zur Beobachtung der doppelten Befruchtung, das in einem Embryosack aufgetreten ist, der aus künstlich bestäubten Stempeln stammt. Mit Spermienkern MarkerLinie HTR10-mRFP7, kann der Befruchtungszustand jeder weiblichen Gamete auf der Grundlage der Spermien Kernsignal Morphologie diskriminiert werden. Unser Protokoll, das sich auf eine solche morphologische Veränderung der Spermienkerne bei der Befruchtung konzentriert, kann effizient eine ausreichende Menge an Daten für den statistischen Nachweis erhalten. Eine DMP9-Knockdown-Linie mit HTR10-mRFP-Hintergrund (DMP9KD/HTR10-mRFP) wurde als männliche Pflanzen verwendet, um ein einzelnes Düngemuster zu zeigen. Das Protokoll eignet sich auch für die funktionelle Analyse anderer Düngeregler.
Protocol
Representative Results
Discussion
HTR10-mRFP-Etiketten väterliches Chromatin (d. h. visualisiert Spermienkerne), und die Dynamik bei der Doppelbefruchtung wurde berichtet7. Unmittelbar nach der Freisetzung aus einem Pollenrohr werden HTR10-mRFP-markierte Spermakerne noch kondensiert. Jedoch, jeder der Spermienkerne wird bei der Verschmelzung mit einem befruchteten weiblichen Gamete-Kern bei Karyogamy drei bis vier Stunden nach Gamete Membranfusion7dekondensiert. Unbefruchtete Spermien bleiben kondensiert, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant (JP17H05832 to T. I.) und durch die Förderung des Strategic Priority Research Promotion Program on Phytochemical Plant Molecular Sciences, Chiba University (Japan) unterstützt.
Materials
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
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| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
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| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 gauge |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA0.75), dry |
References
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