Évaluation de l'état de fertilisation par la recherche de la morphologie nucléaire du sperme dans la double fécondation de l'arabidopsise

Les plantes à fleurs produisent des graines par double fécondation, un processus qui est directement contrôlé par les interactions entre les protéines localisées sur la membrane plasmatique gamète^1,2. Les gamètes mâles de plante de floraison, une paire de spermatozoïdes, se développent dans le pollen. Un tube de pollen qui se développe après la pollinisation fournit une paire de spermatozoïdes aux gamètes femelles, un ovule et une cellule centrale, qui se développent dans un sac d’embryon. Après la rencontre des gamètes mâles et femelles, les protéines sur la surface du gamète favorisent la reconnaissance, l’attachement et la fusion pour compléter la double fécondation. Dans des études antérieures, les protéines mâles de membrane de gamètegenerative CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)^3,4 et GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)⁵ ont été identifiées comme régulateurs de fertilisation impliqués dans la fusion de gamètes et attachement, respectivement. Nous avons récemment identifié une protéine membranaire spécifique au gamète mâle, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), en tant que régulateur de fertilisation impliqué dans l’interaction gamète. Nous avons constaté qu’une diminution de l’expression de DMP9 a comme conséquence l’inhibition significative de la fertilisation de cellules d’oeuf pendant la double fertilisation dans A. thaliana^6.

Comme la double fécondation se produit dans un sac d’embryon, qui est incorporé dans un ovule qui est encore enveloppé avec le tissu d’ovaire, il est difficile d’observer et d’analyser les états des processus de double fécondation. Pour cette raison, il y a encore beaucoup de points peu clairs qui entravent une compréhension complète du mécanisme entier de contrôle de double fertilisation. La mise en place de techniques d’observation pour retracer le comportement des gamètes lors de la double fécondation dans des conditions in vivo est indispensable à l’analyse fonctionnelle des candidats potentiels pour les régulateurs de fécondation. Des études récentes ont donné des lignes de marqueur où les structures sous-cellulaires gamètes sont étiquetées avec des protéines fluorescentes. Dans cet article, nous démontrons un protocole simple et rapide pour observer la double fertilisation qui s’est produite dans un sac d’embryon dérivé des pistils artificiellement pollinisés. L’utilisation de la ligne de marqueurde noyau de cellules de sperme HTR10-mRFP 7, l’état de fertilisation de chaque gamète femelle peut être discriminé sur la base de la morphologie nucléaire de signal de sperme. Notre protocole se concentrant sur un tel changement morphologique des noyaux de sperme à la fertilisation peut obtenir efficacement une quantité suffisante de données pour la preuve statistique. Une ligne DMP9-knockdownavec hTR10-mRFP fond (DMP9^KD/^HTR10-mRFP) a été utilisé comme plantes mâles pour montrer un modèle de fertilisation unique. Le protocole convient également à l’analyse fonctionnelle d’autres organismes de réglementation de la fertilisation.