Valutazione dello stato di fecondazione tracciando lo sperma Morfologia nucleare in Arabidopsis Doppia Fecondazione
Summary
Dimostriamo un metodo per determinare la fecondazione riuscita o fallita sulla base della morfologia nucleare dello sperma nell’Arabidopsis doppia fecondazione utilizzando un microscopio a epifluorescenza.
Abstract
Le piante da fiore hanno un sistema di riproduzione sessuale unico chiamato “doppia fecondazione”, in cui ciascuno spermatozoi si fonde con precisione con una cellula uovo o una cellula centrale. Così, due eventi di fecondazione indipendenti si svolgono quasi simultaneamente. La cellula uovo fecondata e la cellula centrale si sviluppano rispettivamente in zigote ed endosperma. Pertanto, un controllo preciso della doppia fecondazione è essenziale per lo sviluppo del seme che ne consegue. La doppia fecondazione si verifica nel gametophyte femminile (sacco embrionale), che è profondamente nascosto e coperto da spessi tessuti ovuli e ovarici. Questa costruzione del tessuto piisilo rende abbastanza difficile l’osservazione e l’analisi della doppia fecondazione e ha creato la situazione attuale in cui molte domande riguardanti il meccanismo della doppia fecondazione rimangono senza risposta. Per la valutazione funzionale di un potenziale candidato per l’regolatore di fecondazione, l’analisi fenotipica della fecondazione è importante. Per giudicare il completamento della fecondazione in Arabidopsis thaliana, le forme dei segnali di fluorescenza che etichettano i nuclei dello sperma vengono utilizzate come indicatori. Una cellula sperma che non riesce a fertilizzare è indicata da un segnale di fluorescenza condensata al di fuori dei gameti femminili, mentre una cellula sperma che concime con successo è indicata da un segnale dedensato a causa della karyogamia con il nucleo dei gameti femminili. Il metodo qui descritto fornisce uno strumento per determinare la fecondazione riuscita o non riuscita in condizioni di invivo.
Introduction
Le piante da fiore producono semi attraverso la doppia fecondazione, un processo che è direttamente controllato da interazioni tra proteine localizzate sulla membrana plasmatica gameta1,2. Pianta da Fiore gameti maschili, un paio di spermatozoi, si sviluppano in polline. Un tubo di polline che cresce dopo l’impollinazione fornisce una coppia di spermatozoi ai gameti femminili, una cellula uovo e una cellula centrale, che si sviluppano in un sacco embrionale. Dopo che i gameti maschili e femminili si incontrano, le proteine sulla superficie dei gameti promuovono il riconoscimento, l’attaccamento e la fusione per completare la doppia fecondazione. In studi precedenti, le proteine della membrana dei gameti maschili GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2)3,4 e GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 sono state identificate come regolatori di fertilizzazione coinvolti nella fusione dei gameti e rispettivamente l’allegato. Recentemente abbiamo identificato una proteina di membrana specifica del gamete maschile, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), come regolatore di fertilizzazione coinvolto nell’interazione dei gameti. Abbiamo scoperto che una diminuzione dell’espressione DMP9 si traduce in un’inibizione significativa della fecondazione delle cellule ovuli durante la doppia fecondazione in A. thaliana6.
Poiché la doppia fecondazione si verifica in un sacco embrionale, che è incorporato in un ovulo che viene ulteriormente avvolto con tessuto ovarico, è difficile osservare e analizzare gli stati dei processi di doppia fecondazione. Per questo motivo, ci sono ancora molti punti poco chiari che ostacolano una comprensione completa dell’intero meccanismo del controllo della doppia fecondazione. L’istituzione di tecniche di osservazione per tracciare il comportamento dei gameti durante la doppia fecondazione in condizioni in vivo è indispensabile per l’analisi funzionale dei potenziali candidati per i regolatori di fecondazione. Recenti studi hanno prodotto linee marker in cui le strutture subcellulari dei gameti sono etichettate con proteine fluorescenti. In questo articolo, dimostriamo un protocollo semplice e veloce per osservare la doppia fecondazione che si è verificato in un sacco embrionale derivato da pistili artificialmente impollinati. Utilizzando la linea di marcatore del nucleo delle cellule spermatrici HTR10-mRFP7, lo stato di fecondazione di ogni gamete femmina può essere discriminato sulla base della morfologia del segnale nucleare dello sperma. Il nostro protocollo incentrato su un tale cambiamento morfologico dei nuclei spermatozoi alla fecondazione può ottenere in modo efficiente una quantità sufficiente di dati per la prova statistica. Una linea DMP9-knockdown con sfondo HTR10-mRFP (DMP9KD/HTR10-mRFP) è stata utilizzata come piante maschili per mostrare un unico modello di fecondazione. Il protocollo è adatto anche per l’analisi funzionale di altri regolatori di fecondazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etichette HTR10-mRFP cromatina paterna (cioè, visualizza i nuclei delle cellule spermatiche), e la dinamica nella doppia fecondazione sono state segnalate7. Immediatamente dopo il rilascio da un tubo di polline, i nuclei di spermatozoi etichettati con etichetta HTR10-mRFP sono ancora condensati. Tuttavia, ciascuno dei nuclei di sperma viene decondenato dopo la fusione con un nucleo gameti femminile fecondato a karyogamy tre o quattro ore dopo la fusione della membrana gamete7</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione KAKENHI della Japan Society for the Promotion of Science (DA JP17H05832 a T. I.) e dal finanziamento del Programma di Promozione della Ricerca sulle Scienze Molecolari delle Piante Petrolchimiche dell’Università di Chiba (Giappone).
Materials
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
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| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
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| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 gauge |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA0.75), dry |
References
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