Dieses Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Isolierung von Mausrhabdomyosarkom Primärzellen, Tumorsphärenbildung und -behandlung und Allograft-Transplantation ausgehend von Tumorsphärenkulturen.
Rhabdomyosarkom (RMS) ist das häufigste Weichteilsarkom bei Kindern. Obwohl erhebliche Anstrengungen die Identifizierung gemeinsamer Mutationen im Zusammenhang mit RMS ermöglicht haben und die Diskriminierung verschiedener RMS-Subtypen ermöglicht haben, bestehen nach wie vor große Herausforderungen für die Entwicklung neuartiger Behandlungen, um die Prognose weiter zu verbessern. Obwohl durch die Expression myogener Marker identifiziert, gibt es immer noch erhebliche Kontroversen darüber, ob RMS myogene oder nicht-myogene Ursprünge hat, da die Ursprungszelle immer noch schlecht verstanden wird. In der vorliegenden Studie wird eine zuverlässige Methode für den Tumorsphären-Assay für Maus-RMS bereitgestellt. Der Assay basiert auf funktionellen Eigenschaften von Tumorzellen und ermöglicht die Identifizierung seltener Populationen im Tumor mit tumorgenen Funktionen. Ebenfalls beschrieben sind Verfahren zum Testen rekombinanter Proteine, zur Integration von Transfektionsprotokollen mit dem Tumorsphärentest und zur Bewertung von Kandidatengenen, die an der Tumorentwicklung und -wachstum beteiligt sind. Weiter beschrieben ist ein Verfahren zur Allograft-Transplantation von Tumorsphären in Empfängermäuse, um die tumorgene Funktion in vivozu validieren. Insgesamt ermöglicht die beschriebene Methode eine zuverlässige Identifizierung und Prüfung seltener RMS-Tumorenpopulationen, die auf RMS angewendet werden können, die in verschiedenen Kontexten auftreten. Schließlich kann das Protokoll als Plattform für das Screening von Arzneimitteln und die zukünftige Entwicklung von Therapeutika genutzt werden.
Krebs ist eine heterogene Krankheit; darüber hinaus kann die gleiche Art von Tumor verschiedene genetische Mutationen bei verschiedenen Patienten darstellen, und innerhalb eines Patienten wird ein Tumor aus mehreren Populationen von Zellen1zusammengesetzt. Heterogenität stellt eine Herausforderung bei der Identifizierung von Zellen dar, die für die Initiierung und Verbreitung von Krebs verantwortlich sind, aber ihre Charakterisierung ist für die Entwicklung effizienter Behandlungen von entscheidender Bedeutung. Der Begriff der Tumor-Vermehrungszellen (TPC), eine seltene Population von Zellen, die zur Tumorentwicklung beitragen, wurde zuvor ausführlich überprüft2. Trotz der Tatsache, dass TPCs bei mehreren Krebsarten charakterisiert wurden, bleibt die Identifizierung von Markern für ihre zuverlässige Isolierung eine Herausforderung für mehrere Tumortypen3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. So kann ein Verfahren, das sich nicht auf molekulare Marker stützt, sondern auf TPC-Funktionseigenschaften (hohe Selbsterneuerung und die Fähigkeit, unter Niedriganhaftungsbedingungen zu wachsen), bekannt als Tumorsphärenbildungstest, weit verbreitet für die Identifizierung von TPCs aus den meisten Tumoren. Wichtig ist, dass dieser Assay auch für die Erweiterung von TPCs eingesetzt werden kann und somit direkt auf Krebsmedikamenten-Screening und Studien zur Krebsresistenz1,10angewendet wird.
Rhabdomyosarkom (RMS) ist eine seltene Form von Weichteilsarkom am häufigsten bei kleinen Kindern11. Althoug RMS kann durch die Beurteilung der Expression myogener Marker histologisch identifiziert werden, die RMS-Ursprungszelle wurde aufgrund der multiplen Tumorsubtypen und der hohen Heterogenität der Tumorentwicklungsreize nicht eindeutig charakterisiert. Tatsächlich haben neuere Studien eine signifikante wissenschaftliche Diskussion darüber ausgelöst, ob RMS myogene oder nicht myogene Ursprünge hat, was darauf hindeutet, dass RMS je nach Kontext12,13 von verschiedenen Zelltypen stammen kann. 14 , 15 , 16 , 17. Zahlreiche Studien an RMS-Zelllinien wurden mit dem Tumorsphärenbildungstest zur Identifizierung von Pfaden durchgeführt, die an der Tumorentwicklung und der Charakterisierung von Markern beteiligt sind, die mit stark selbsterneuernden Populationen assoziiert sind. 18 , 19 , 20 , 21.
Trotz des Potenzials des Tumorsphärenbildungs-Assays zur Identifizierung von RMS-Ursprungszellen wurde jedoch noch keine zuverlässige Methode beschrieben, die auf primären RMS-Zellen angewendet werden kann. In diesem Zusammenhang verwendete eine aktuelle Studie unserer Gruppe einen optimierten Tumorsphärenbildungstest zur Identifizierung der RMS-Ursprungszellen in einem Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) Mausmodell22. Mehrere prätumorogene Zelltypen, die aus Muskelgeweben isoliert sind, werden auf ihre Fähigkeit getestet, unter bedingungen mit geringer Anhaftung zu wachsen, was die Identifizierung von Muskelstammzellen als Ursprungszellen für RMS in dystrophischen Kontexten ermöglicht. Beschrieben wird hier ein reproduzierbares und zuverlässiges Protokoll für den Tumorsphärenbildungstest (Abbildung 1), das erfolgreich zur Identifizierung extrem seltener Zellpopulationen eingesetzt wurde, die für die Entwicklung von Maus-RMS verantwortlich sind.
Mehrere Methoden wurden für die Isolierung und Charakterisierung von TPCs aus Tumor heterogenen Zellpopulationen eingesetzt: Tumor-Clonogene-Assays, FACS-Isolation und Tumorsphärenbildung. Der Tumor-Clonogen-Assay wurde erstmals 1971 beschrieben, für Stammzellstudien verwendet und erst später auf die Krebsbiologieangewendet 29,30. Diese Methode basiert auf der intrinsischen Eigenschaft der Krebsstammzellen, um sich ohne Einschränkungen in weichen Gelkulturen…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch das Ellison Medical Foundation Grant AG-NS-0843-11 und den NIH Pilot Grant im Rahmen des NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199 an A.S. unterstützt.
Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
Penicillin – Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |