Summary

Tumorsphäre Ableitung und Behandlung von primären Tumorzellen isoliert von Maus Rhabdomyosarkomen

Published: September 13, 2019
doi:

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Isolierung von Mausrhabdomyosarkom Primärzellen, Tumorsphärenbildung und -behandlung und Allograft-Transplantation ausgehend von Tumorsphärenkulturen.

Abstract

Rhabdomyosarkom (RMS) ist das häufigste Weichteilsarkom bei Kindern. Obwohl erhebliche Anstrengungen die Identifizierung gemeinsamer Mutationen im Zusammenhang mit RMS ermöglicht haben und die Diskriminierung verschiedener RMS-Subtypen ermöglicht haben, bestehen nach wie vor große Herausforderungen für die Entwicklung neuartiger Behandlungen, um die Prognose weiter zu verbessern. Obwohl durch die Expression myogener Marker identifiziert, gibt es immer noch erhebliche Kontroversen darüber, ob RMS myogene oder nicht-myogene Ursprünge hat, da die Ursprungszelle immer noch schlecht verstanden wird. In der vorliegenden Studie wird eine zuverlässige Methode für den Tumorsphären-Assay für Maus-RMS bereitgestellt. Der Assay basiert auf funktionellen Eigenschaften von Tumorzellen und ermöglicht die Identifizierung seltener Populationen im Tumor mit tumorgenen Funktionen. Ebenfalls beschrieben sind Verfahren zum Testen rekombinanter Proteine, zur Integration von Transfektionsprotokollen mit dem Tumorsphärentest und zur Bewertung von Kandidatengenen, die an der Tumorentwicklung und -wachstum beteiligt sind. Weiter beschrieben ist ein Verfahren zur Allograft-Transplantation von Tumorsphären in Empfängermäuse, um die tumorgene Funktion in vivozu validieren. Insgesamt ermöglicht die beschriebene Methode eine zuverlässige Identifizierung und Prüfung seltener RMS-Tumorenpopulationen, die auf RMS angewendet werden können, die in verschiedenen Kontexten auftreten. Schließlich kann das Protokoll als Plattform für das Screening von Arzneimitteln und die zukünftige Entwicklung von Therapeutika genutzt werden.

Introduction

Krebs ist eine heterogene Krankheit; darüber hinaus kann die gleiche Art von Tumor verschiedene genetische Mutationen bei verschiedenen Patienten darstellen, und innerhalb eines Patienten wird ein Tumor aus mehreren Populationen von Zellen1zusammengesetzt. Heterogenität stellt eine Herausforderung bei der Identifizierung von Zellen dar, die für die Initiierung und Verbreitung von Krebs verantwortlich sind, aber ihre Charakterisierung ist für die Entwicklung effizienter Behandlungen von entscheidender Bedeutung. Der Begriff der Tumor-Vermehrungszellen (TPC), eine seltene Population von Zellen, die zur Tumorentwicklung beitragen, wurde zuvor ausführlich überprüft2. Trotz der Tatsache, dass TPCs bei mehreren Krebsarten charakterisiert wurden, bleibt die Identifizierung von Markern für ihre zuverlässige Isolierung eine Herausforderung für mehrere Tumortypen3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. So kann ein Verfahren, das sich nicht auf molekulare Marker stützt, sondern auf TPC-Funktionseigenschaften (hohe Selbsterneuerung und die Fähigkeit, unter Niedriganhaftungsbedingungen zu wachsen), bekannt als Tumorsphärenbildungstest, weit verbreitet für die Identifizierung von TPCs aus den meisten Tumoren. Wichtig ist, dass dieser Assay auch für die Erweiterung von TPCs eingesetzt werden kann und somit direkt auf Krebsmedikamenten-Screening und Studien zur Krebsresistenz1,10angewendet wird.

Rhabdomyosarkom (RMS) ist eine seltene Form von Weichteilsarkom am häufigsten bei kleinen Kindern11. Althoug RMS kann durch die Beurteilung der Expression myogener Marker histologisch identifiziert werden, die RMS-Ursprungszelle wurde aufgrund der multiplen Tumorsubtypen und der hohen Heterogenität der Tumorentwicklungsreize nicht eindeutig charakterisiert. Tatsächlich haben neuere Studien eine signifikante wissenschaftliche Diskussion darüber ausgelöst, ob RMS myogene oder nicht myogene Ursprünge hat, was darauf hindeutet, dass RMS je nach Kontext12,13 von verschiedenen Zelltypen stammen kann. 14 , 15 , 16 , 17. Zahlreiche Studien an RMS-Zelllinien wurden mit dem Tumorsphärenbildungstest zur Identifizierung von Pfaden durchgeführt, die an der Tumorentwicklung und der Charakterisierung von Markern beteiligt sind, die mit stark selbsterneuernden Populationen assoziiert sind. 18 , 19 , 20 , 21.

Trotz des Potenzials des Tumorsphärenbildungs-Assays zur Identifizierung von RMS-Ursprungszellen wurde jedoch noch keine zuverlässige Methode beschrieben, die auf primären RMS-Zellen angewendet werden kann. In diesem Zusammenhang verwendete eine aktuelle Studie unserer Gruppe einen optimierten Tumorsphärenbildungstest zur Identifizierung der RMS-Ursprungszellen in einem Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) Mausmodell22. Mehrere prätumorogene Zelltypen, die aus Muskelgeweben isoliert sind, werden auf ihre Fähigkeit getestet, unter bedingungen mit geringer Anhaftung zu wachsen, was die Identifizierung von Muskelstammzellen als Ursprungszellen für RMS in dystrophischen Kontexten ermöglicht. Beschrieben wird hier ein reproduzierbares und zuverlässiges Protokoll für den Tumorsphärenbildungstest (Abbildung 1), das erfolgreich zur Identifizierung extrem seltener Zellpopulationen eingesetzt wurde, die für die Entwicklung von Maus-RMS verantwortlich sind.

Protocol

Das Gehäuse, die Behandlung und das Opfer von Mäusen wurden nach dem genehmigten IACUC-Protokoll des Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute durchgeführt. 1. Reagenzzubereitung Bereiten Sie 100 ml Zellisolationsmedien vor: F10 Medium ergänzt mit 10% Pferdeserum (HS). 50 ml Kollagenase Typ II Lösung vorbereiten: 1 g Kollagenase Typ II Pulver in 50 ml Zellisolationsmedien auflösen (beachten Sie die Einheiten des Enzyms pro 1 ml Medium, da sich die Anzahl der …

Representative Results

Tumorsphären-ErkennungDie Zellisolation wurde optimiert, um die maximale Heterogenität der im Tumorgewebe vorhandenen Zellpopulationen zu erhalten. Erstens, da isolierte Gewebe morphologisch unterschiedliche Bereiche präsentierten, um die Chancen der Isolierung einheitlicher seltener Zellpopulationen zu erhöhen, wurde eine Probenahme aus mehreren Bereichen des Tumors durchgeführt(Abbildung 1A, erstes Panel auf der linken Seite). Zwei…

Discussion

Mehrere Methoden wurden für die Isolierung und Charakterisierung von TPCs aus Tumor heterogenen Zellpopulationen eingesetzt: Tumor-Clonogene-Assays, FACS-Isolation und Tumorsphärenbildung. Der Tumor-Clonogen-Assay wurde erstmals 1971 beschrieben, für Stammzellstudien verwendet und erst später auf die Krebsbiologieangewendet 29,30. Diese Methode basiert auf der intrinsischen Eigenschaft der Krebsstammzellen, um sich ohne Einschränkungen in weichen Gelkulturen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch das Ellison Medical Foundation Grant AG-NS-0843-11 und den NIH Pilot Grant im Rahmen des NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199 an A.S. unterstützt.

Materials

Accutase cell dissociation reagent Gibco A1110501 Detach adherent cells and dissociate tumorspheres
Celigo Nexcelom Celigo Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells
Collagenase, Type II Life Technologies 17101015 Tissue digestion enzyme
Dispase II, protease Life Technologies 17105041 Tissue digestion enzyme
DMEM high glucose media Gibco 11965092 Component of tumor cells media
DMEM/F12 Media Gibco 11320033 Component of tumosphere media
EDTA ThermoFisher S312500 Component of FACS buffer
EGF recombinant mouse protein Gibco PMG8041 Component of tumosphere media
FACSAria II Flow Cytometry BD Biosciences 650033 Fluorescent activated cell sorter
Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-11 Component of tumor cells media
Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent MWI Vet Supply 502017 Anesthetic reagent for animals
FxCycle Violet Stain Life Technologies F10347 Discriminate live and dead cells
Goat Serum Life Technologies 16210072 Component of FACS buffer
Ham's F10 Media Life Technologies 11550043 Component of FACS buffer
Horse Serum Life Technologies 16050114 Component of cell isolation media
Lipofectamine 3000 transfection reagent ThermoFisher L3000015 Transfection Reagent
Matrigel membrane matrix Corning CB40234 Provides support to trasplanted cells
N-2 Supplemtns (100X) Gibco 17502048 Component of tumosphere media
Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment MWI Vet Supply 701008 Eyes ointment
PBS Gibco 10010023 Component of FACS buffer and used for washing cells
pEGFP-C1 Addgene 6084-1 GFP plasmid
Penicillin – Streptomyocin Life Technologies 15140163 Component of tumosphere and tumor cells media
Recombinant Human βFGF-basic Peprotech 10018B Component of tumosphere media
Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein R&D Systems 427-FL-005 Recombinant protein
Trypan blue ThermoFisher 15250061 Discriminate live and dead cells

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Cite This Article
Boscolo Sesillo, F., Sacco, A. Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas. J. Vis. Exp. (151), e59897, doi:10.3791/59897 (2019).

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