Summary

Derivación y tratamiento de tumoresferas a partir de células tumorales primarias aisladas de Rhabdomyosarcomas de ratón

Published: September 13, 2019
doi:

Summary

Este protocolo describe un método reproducible para el aislamiento de las células primarias de rabdomiosarcoma de ratón, la formación y el tratamiento de la tumoresfera y el trasplante de aloinjertoado a partir de cultivos de tumoresferas.

Abstract

El rabdomiosarcoma (RMS) es el sarcoma de tejido blando más común en niños. Aunque los esfuerzos significativos han permitido la identificación de mutaciones comunes asociadas con la RMS y han permitido la discriminación de diferentes subtipos de SRM, todavía existen grandes desafíos para el desarrollo de nuevos tratamientos para mejorar aún más el pronóstico. Aunque se identifica por la expresión de marcadores miogénicos, todavía hay una controversia significativa sobre si el RMS tiene orígenes miogénicos o no miogénicos, ya que la célula de origen todavía se entiende mal. En el presente estudio, se proporciona un método fiable para el ensayo de tumoresfera para rmS de ratón. El ensayo se basa en las propiedades funcionales de las células tumorales y permite la identificación de poblaciones raras en el tumor con funciones tumorigénicas. También se describen los procedimientos para analizar proteínas recombinantes, integrar protocolos de transfección con el ensayo de tumoresfera y evaluar los genes candidatos implicados en el desarrollo y crecimiento tumoral. Además, se describe un procedimiento para el trasplante de tumoresferas de aloinjertos en ratones receptores para validar la función tumorigénica in vivo. En general, el método descrito permite la identificación y prueba fiables de poblaciones tumorigénicas RMS raras que se pueden aplicar a los RMS que surgen en diferentes contextos. Por último, el protocolo se puede utilizar como una plataforma para la detección de drogas y el desarrollo futuro de terapias.

Introduction

El cáncer es una enfermedad heterogénea; además, el mismo tipo de tumor puede presentar diferentes mutaciones genéticas en diferentes pacientes, y dentro de un paciente un tumor está compuesto por múltiples poblaciones de células1. La heterogeneidad presenta un desafío en la identificación de las células responsables de iniciar y propagar el cáncer, pero su caracterización es esencial para el desarrollo de tratamientos eficientes. La noción de células propagantes tumorales (TPC), una población rara de células que contribuyen al desarrollo tumoral, ha sido previamente ampliamente revisada2. A pesar de que los TPM se han caracterizado en múltiples tipos de cáncer, la identificación de marcadores para su aislamiento fiable sigue siendo un desafío para varios tipos de tumores3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. Por lo tanto, un método que no se basa en marcadores moleculares, sino más bien en las propiedades funcionales de TPC (alta auto-renovación y la capacidad de crecer en condiciones de baja fijación), conocido como el ensayo de formación de tumoresfera, puede ser ampliamente aplicado para el identificación de los TPC de la mayoría de los tumores. Es importante destacar que este ensayo también puede emplearse para la expansión de los Tpm y, por lo tanto, se aplica directamente a la detección de fármacos contra el cáncer y estudios sobre la resistencia al cáncer1,10.

El rabdomiosarcoma (RMS) es una forma rara de sarcoma de tejido blando más común en niños pequeñosde 11años. Althoug RMS se puede identificar histológicamente a través de la evaluación de la expresión de marcadores miogénicos, la célula de origen RMS no se ha caracterizado unívocamente debido a los múltiples subtipos tumorales y alta heterogeneidad de los estímulos de desarrollo tumoral. De hecho, estudios recientes han generado una discusión científica significativa sobre si el RMS es de origen miogénico o no miogénico, lo que sugiere que el RMS puede derivar de diferentes tipos de células dependiendo del contexto12,13, 14 , 15 , 16 , 17. Se han realizado numerosos estudios sobre líneas celulares RMS empleando el ensayo de formación de tumoresfera para la identificación de vías implicadas en el desarrollo tumoral y caracterización de marcadores asociados a poblaciones altamente auto-renovables 18 , 19 , 20 , 21.

Sin embargo, a pesar del potencial del ensayo de formación de tumoresfera para identificar células RMS de origen, aún no se ha descrito un método confiable que pueda emplearse en células primarias de RMS. En este contexto, un estudio reciente de nuestro grupo empleó un ensayo optimizado de formación de tumoresfera para la identificación de las células RMS de origen en un ratón de distrofia muscular de Duchenne (DMD) modelo22. Múltiples tipos de células pretumigenas, aisladas de los tejidos musculares, se prueban por su capacidad para crecer en condiciones de baja fijación, permitiendo la identificación de células madre musculares como células de origen para RMS en contextos distróficos. Aquí se describe un protocolo reproducible y fiable para el ensayo de formación de la tumoresfera(Figura 1), que se ha empleado con éxito para la identificación de poblaciones celulares extremadamente raras que son responsables del desarrollo de RMS de ratón.

Protocol

La vivienda, el tratamiento y el sacrificio de ratones se realizaron siguiendo el protocolo IACUC aprobado del Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute. 1. Preparación de reactivos Preparar 100 ml de medios de aislamiento celular: Medio F10 complementado con 10% de suero de caballo (HS). Preparar 50 ml de solución de colagenasa tipo II: disolver 1 g de polvo de colagenasa tipo II en 50 ml de medios de aislamiento celular (tenga en cuenta las unidades de la enzim…

Representative Results

Detección de tumoresferasEl aislamiento celular se optimizó para obtener la máxima heterogeneidad de las poblaciones celulares presentes en el tejido tumoral. En primer lugar, dado que los tejidos aislados presentaban áreas morfológicamente diferentes, para aumentar las posibilidades de aislar poblaciones uniformes de células raras, se realizó un muestreo de múltiples áreas del tumor(Figura 1A,primer panel a la izquierda). En seg…

Discussion

Se han empleado múltiples métodos para el aislamiento y caracterización de los TPC de las poblaciones de células heterogéneas tumorales: ensayos clonogénicos tumorales, aislamiento FACS y ensayo de formación de tumoresfera. El ensayo clonogénico tumoral fue descrito por primera vez en 1971, utilizado para estudios con células madre, y sólo se aplicó posteriormente a la biología del cáncer29,30. Este método se basa en la propiedad intrínseca de las …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la beca AG-NS-0843-11 de Ellison Medical Foundation y la Beca Piloto NIH dentro de la Subvención de Apoyo del Centro OnCI para el Cáncer P30CA030199 a A.S.

Materials

Accutase cell dissociation reagent Gibco A1110501 Detach adherent cells and dissociate tumorspheres
Celigo Nexcelom Celigo Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells
Collagenase, Type II Life Technologies 17101015 Tissue digestion enzyme
Dispase II, protease Life Technologies 17105041 Tissue digestion enzyme
DMEM high glucose media Gibco 11965092 Component of tumor cells media
DMEM/F12 Media Gibco 11320033 Component of tumosphere media
EDTA ThermoFisher S312500 Component of FACS buffer
EGF recombinant mouse protein Gibco PMG8041 Component of tumosphere media
FACSAria II Flow Cytometry BD Biosciences 650033 Fluorescent activated cell sorter
Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-11 Component of tumor cells media
Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent MWI Vet Supply 502017 Anesthetic reagent for animals
FxCycle Violet Stain Life Technologies F10347 Discriminate live and dead cells
Goat Serum Life Technologies 16210072 Component of FACS buffer
Ham's F10 Media Life Technologies 11550043 Component of FACS buffer
Horse Serum Life Technologies 16050114 Component of cell isolation media
Lipofectamine 3000 transfection reagent ThermoFisher L3000015 Transfection Reagent
Matrigel membrane matrix Corning CB40234 Provides support to trasplanted cells
N-2 Supplemtns (100X) Gibco 17502048 Component of tumosphere media
Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment MWI Vet Supply 701008 Eyes ointment
PBS Gibco 10010023 Component of FACS buffer and used for washing cells
pEGFP-C1 Addgene 6084-1 GFP plasmid
Penicillin – Streptomyocin Life Technologies 15140163 Component of tumosphere and tumor cells media
Recombinant Human βFGF-basic Peprotech 10018B Component of tumosphere media
Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein R&D Systems 427-FL-005 Recombinant protein
Trypan blue ThermoFisher 15250061 Discriminate live and dead cells

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Boscolo Sesillo, F., Sacco, A. Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas. J. Vis. Exp. (151), e59897, doi:10.3791/59897 (2019).

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