اشتقاق الأورام والعلاج من الخلايا السرطانية الأولية المعزولة من الساركوما الروماتيزمية الماوس
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة قابلة للاستنساخ لعزل الخلايا الأولية لالروماتيزم الفأر، وتشكيل الأورام وعلاجها، وزرع الطعوم بدءاً من ثقافات الأورام.
Abstract
الساركوما الروماتيزمية (RMS) هي ساركوما الأنسجة الرخوة الأكثر شيوعًا لدى الأطفال. وعلى الرغم من أن الجهود الكبيرة قد مكنت من تحديد الطفرات الشائعة المرتبطة بـ RMS وسمحت بالتمييز بين مختلف الأنواع الفرعية لـ RMS، لا تزال هناك تحديات كبيرة أمام تطوير علاجات جديدة لزيادة تحسين التكهن. على الرغم من أن تحديدها من خلال التعبير عن علامات myogenic، لا يزال هناك جدل كبير حول ما إذا كان RMS لديه أصول myogenic أو غير myogenic، كما خلية المنشأ لا يزال غير مفهومة بشكل جيد. في هذه الدراسة، يتم توفير طريقة موثوق بها للبفحص الورم للماوس RMS. ويستند هذا القول على الخصائص الوظيفية للخلايا السرطانية ويسمح بتحديد السكان النادرين في الورم مع وظائف الورم. كما تم وصف إجراءات اختبار البروتينات المؤتلفة، ودمج بروتوكولات التغوط مع فحص محيط الأورام، وتقييم الجينات المرشحة المشاركة في تطوير الورم والنمو. كما هو موضح هو إجراء لزرع الطعوم من الأورام في الفئران المتلقية للتحقق من وظيفة الورم في الجسم الحي. بشكل عام، تسمح الطريقة الموصوفة بتحديد واختبار السكان النادرين في RMS التي يمكن تطبيقها على RMS الناشئة في سياقات مختلفة. وأخيرا، يمكن استخدام البروتوكول كمنبر لفحص المخدرات والتطوير المستقبلي للعلاجات.
Introduction
السرطان هو مرض غير متجانس. وعلاوة على ذلك، فإن نفس النوع من الورم يمكن أن يقدم طفرات جينية مختلفة في مختلف المرضى، وداخل المريض يتكون الورم من مجموعات متعددة من الخلايا1. ويشكل عدم التجانس تحديا في تحديد الخلايا المسؤولة عن بدء انتشار السرطان، ولكن توصيفها ضروري لتطوير علاجات فعالة. فكرة نشر الخلايا الورم (TPC)، وهي مجموعة نادرة من الخلايا التي تسهم في تطوير الورم، وقد تم استعراضها سابقا على نطاق واسع2. على الرغم من حقيقة أن TPCs قد تميزت في أنواع متعددة من السرطان، وتحديد علامات لعزلتها موثوق بها لا يزال تحديا لعدة أنواع الورم3،4،5،6 , 7 , 8 , 9. وهكذا، يمكن تطبيق طريقة لا تعتمد على العلامات الجزيئية ولكن بدلا من ذلك على خصائص وظيفية TPC (التجديد الذاتي عالية والقدرة على النمو في ظروف منخفضة المرفق)، والمعروفة باسم اختبار تشكيل الورم، على نطاق واسع ل تحديد TPCs من معظم الأورام. الأهم من ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذا الفحص لتوسيع TPCs وبالتالي تطبق مباشرة على فحص المخدرات السرطان والدراسات على مقاومة السرطان1،10.
الساركوما الروماتيزمية (RMS) هو شكل نادر من ساركوما الأنسجة الرخوة الأكثر شيوعا في الأطفال الصغار11. Althoug RMS يمكن تحديدها من الناحية النسيجية من خلال تقييم التعبير عن علامات myogenic، لم يتم وصف خلية أصل RMS بشكل أحادي الصوت بسبب الأنواع الفرعية الورم متعددة وعدم تجانس عالية من المحفزات التنموية الورم. في الواقع، وقد ولدت الدراسات الحديثة مناقشة علمية هامة حول ما إذا كان RMS هو من أصول myogenic أو غير myogenic، مما يشير إلى أن RMS قد تستمد من أنواع الخلايا المختلفة اعتمادا على السياق12،13، 14 سنة , 15 , 16 سنة , 17. وقد أجريت دراسات عديدة على خطوط الخلايا RMS باستخدام اختبار تشكيل الورم لتحديد المسارات المشاركة في تطوير الورم وتوصيف علامات المرتبطة السكان التجديد الذاتي للغاية 18 سنة , 19 سنة , 20 , 21.
ومع ذلك، على الرغم من إمكانية اختبار تشكيل محيط الورم لتحديد خلايا RMS المنشأ، لم يتم بعد وصف طريقة موثوق بها التي يمكن استخدامها على خلايا RMS الأولية. في هذا السياق، استخدمت دراسة حديثة من مجموعتنا فحص تشكيل الورم الأمثل لتحديد خلايا RMS المنشأ في ضمور العضلات دوشين (DMD) نموذج الماوس22. يتم اختبار أنواع متعددة من الخلايا قبل الورم، معزولة عن أنسجة العضلات، لقدرتها على النمو في ظروف منخفضة التعلق، مما يسمح بتحديد الخلايا الجذعية العضلية كخلايا المنشأ لRMS في سياقات عسر التغذية. يوصف هنا هو بروتوكول قابل للاستنساخ وموثوق بها لتصور تشكيل الورم (الشكل 1)، والتي تم استخدامها بنجاح لتحديد مجموعات الخلايا النادرة للغاية التي هي المسؤولة عن تطوير RMS الماوس.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدمت أساليب متعددة لعزل وتوصيف TPCs من مجموعات الخلايا غير المتجانسة الورم: اختبار الورم clonogenic، عزل FACS، ودراسة تشكيل الورم. تم وصف فحص الورم الكلوجيني لأول مرة في عام 1971، ويستخدم لدراسات الخلايا الجذعية، ويطبق فقط في وقت لاحق على بيولوجيا السرطان29،30. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة إليسون الطبية منحAG-NS-0843-11، والمنحة التجريبية للمعهد الوطني للصحة ضمن منحة دعم مركز السرطان NCI P30CA030199 إلى A.S.
Materials
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin – Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
References
- Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
- Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea–a paradigm shift. Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. Molecular biology of liver cancer stem cells. Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).
- Crous, A. M., Abrahamse, H. Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy. Stem Cell Research & Therapy. 4 (5), 129 (2013).
- Tomao, F., et al. Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells. Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).
- Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease. Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).
- Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods. Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
- Lee, C. -. H., Yu, C. -. C., Wang, B. -. Y., Chang, W. -. W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).
- Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program. Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).
- Blum, J. M., et al. Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells. Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).
- Rubin, B. P., et al. Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).
- Keller, C., et al. Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity. of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes & Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).
- Tremblay, A. M., et al. The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation. Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).
- Hatley, M. E., et al. A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage. Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).
- Drummond, C. J., et al. Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors. Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).
- Almazan-Moga, A., et al. Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma. Stem Cells International. , (2017).
- Walter, D., et al. CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Ciccarelli, C., et al. Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population. Molecular Cancer. 15, (2016).
- Deel, M. D., et al. The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).
- Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy. Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).
- Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).
- Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).
- Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. In vitro Tumorsphere Formation Assays. Bio-Protocol. 3 (3), (2013).
- Zhu, Z. W., et al. A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers. Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).
- Takahashi, S. Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications. Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).
- Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation. Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).
- Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells. Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197 (4302), 461-463 (1977).
- Hamburger, A. W. The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology. The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).
- Jimenez-Hernandez, L. E., et al. NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties. Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Salerno, M., et al. Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas. International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).
