Mouse Rhabdomiyosarkomlardan İzole Edilen Primer Tümör Hücrelerinden Tümörfer Türevve Tedavisi
Summary
Bu protokol, fare rabdomiyosarkom primer hücrelerinin izolasyonu, tümörsphere oluşumu ve tedavisi ve tümörküre kültürlerinden başlayan allograft transplantasyonu için tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlar.
Abstract
Rhabdomyosarkom (RMS) çocuklarda en sık görülen yumuşak doku sarkomudur. Önemli çabalar RMS ile ilişkili yaygın mutasyonların belirlenmesini ve farklı RMS alt tiplerinin ayrımcılığa izin vermesine rağmen, prognozu daha da iyileştirmek için yeni tedavilerin geliştirilmesinde hala büyük zorluklar vardır. Miyojenik belirteçlerin ekspresyonu ile tanımlansa da, rms’nin miyojenik mi yoksa miyojenik olmayan kökenleri mi yoksa miyojenik olmayan kökenleri mi olduğu konusunda hala önemli tartışmalar vardır, çünkü menşe hücresi hala tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çalışmada fare RMS için tümörfer tetkik için güvenilir bir yöntem sağlanmıştır. Test tümör hücrelerinin fonksiyonel özelliklerine dayanmaktadır ve tümörijenik fonksiyonlar ile tümörnadir popülasyonların belirlenmesini sağlar. Ayrıca rekombinant proteinlerin test edilmesi, transfeksiyon protokollerinin tümörküre testi ile bütünleştirilmesi ve tümör gelişimi ve büyümesinde rol oynayan aday genlerin değerlendirilmesi için yapılan prosedürler de tanımlanmıştır. Ayrıca açıklanan in vivotümörijenik fonksiyonu doğrulamak için alıcı fareler içine tümörkürelerin allogreft nakli için bir prosedürdür . Genel olarak, açıklanan yöntem, farklı bağlamlarda ortaya çıkan RMS’lere uygulanabilen nadir RMS tümörijenik popülasyonların güvenilir bir şekilde tanımlanmasına ve test edilmesine olanak sağlar. Son olarak, protokol ilaç taraması ve terapötik gelecekteki gelişimi için bir platform olarak kullanılabilir.
Introduction
Kanser heterojen bir hastalıktır; ayrıca, aynı tip tümör farklı hastalarda farklı genetik mutasyonlar sunabilir, ve bir hasta içinde bir tümör hücrelerin birden fazla popülasyonları oluşur1. Heterojenlik, kanserin başlatılmasından ve yayılmasından sorumlu hücrelerin belirlenmesinde bir sorun teşkil eder, ancak bunların karakterizasyonu etkin tedavilerin geliştirilmesi için gereklidir. Tümör yayılma hücreleri kavramı (TPC), tümör gelişimine katkıda bulunan hücrelerin nadir bir popülasyon, daha önce kapsamlı olarak gözden geçirilmiştir2. TPTS kanser birden fazla tip karakterize olmasına rağmen, onların güvenilir izolasyon için belirteçleri belirlenmesi çeşitli tümör tipleri için bir sorun olmaya devam etmektedir3,4,5,6 , 7.000 , 8.000 , 9– Bu nedenle, moleküler belirteçlere değil, TPC fonksiyonel özelliklerine (yüksek kendini yenileme ve düşük bağlanma koşullarında büyüme yeteneği) dayanan bir yöntem, tümörküre oluşumu tsay olarak bilinen, yaygın olarak uygulanabilir çoğu tümörden TPC’lerin belirlenmesi. Daha da önemlisi, bu tsay da TPCs genişlemesi için istihdam edilebilir ve böylece doğrudan kanser ilaç tarama ve kanserdirenciçalışmaları 1 ,10.
Rhabdomyosarcoma (RMS) yumuşak doku sarkomu en küçük çocuklarda en sık görülen birformudur 11. Althoug RMS histolojik olarak miyojenik belirteçlerin ekspresyonunun değerlendirilmesi ile saptanabilir, RMS kökenli hücre birden fazla tümör alt tipleri ve tümör gelişimsel uyaranlarının yüksek heterojenliği nedeniyle tek kesin olarak karakterize edilmemiştir. Nitekim, son çalışmalar RMS miyojenik veya non-miyojenik kökenli olup olmadığı hakkında önemli bilimsel tartışma üretti, RMS bağlam12bağlı olarak farklı hücre tiplerinden elde edilebilir düşündüren 12,13, 14.000 , 15.000 , 16.02.20 , 17– Tümör gelişimi ve yüksek oranda kendini yenileme popülasyonları ile ilişkili belirteçlerin karakterizasyonu ile ilgili yolların belirlenmesi için tümörküre oluşumu tetkiklerinin geliştirilmesi için RMS hücre hatları üzerinde çok sayıda çalışma yapılmıştır. 18.000 , 19.09.20 , 20.000 , 21. yıl.
Ancak, tümörküre oluşumu tsay kökenli RMS hücrelerini tanımlamak için potansiyeline rağmen, birincil RMS hücreleri üzerinde istihdam edilebilir güvenilir bir yöntem henüz tarif edilmemiştir. Bu bağlamda, grubumuzdan yeni bir çalışmada duchenne kas distrofisi (DMD) fare modeli22kökenli RMS hücrelerinin belirlenmesi için optimize edilmiş bir tümörsphere oluşumu tetkik istihdam . Kas dokularından izole edilmiş birden fazla pre-tümörijenik hücre tipi, düşük bağlanma koşullarında büyüme yetenekleri açısından test edilerek, distrofik bağlamlarda RMS için başlangıç hücreleri olarak kas kök hücrelerinin tanımlanmasına olanak sağlar. Burada tanımlanan, fare RMS gelişiminden sorumlu son derece nadir hücre popülasyonlarının belirlenmesinde başarıyla kullanılan tümörsphere formasyon uyrmuş test(Şekil 1)için tekrarlanabilir ve güvenilir bir protokoldür.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tümör klojen iyotlar, FACS izolasyonu ve tümörsphere formasyon testi: tümör klojeni tahlilleri, tümör klojeni tahlilleri ve tümörsphere oluşumu tahlillerinden TBM’lerin izolasyonu ve karakterizasyonu için birden fazla yöntem kullanılmıştır. Tümör klojenisi titreti ilk olarak 1971 yılında tanımlanmıştır, kök hücre çalışmaları için kullanılan, ve sadece daha sonra kanser biyolojisi29uygulanan,30. Bu yöntem yumuşak jeller kültürl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ellison Medical Foundation hibe AG-NS-0843-11 ve NCI Kanser Merkezi Destek Hibe P30CA030199 a.S. içinde NIH Pilot Grant tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin – Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
References
- Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
- Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea–a paradigm shift. Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. Molecular biology of liver cancer stem cells. Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).
- Crous, A. M., Abrahamse, H. Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy. Stem Cell Research & Therapy. 4 (5), 129 (2013).
- Tomao, F., et al. Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells. Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).
- Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease. Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).
- Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods. Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
- Lee, C. -. H., Yu, C. -. C., Wang, B. -. Y., Chang, W. -. W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).
- Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program. Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).
- Blum, J. M., et al. Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells. Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).
- Rubin, B. P., et al. Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).
- Keller, C., et al. Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity. of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes & Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).
- Tremblay, A. M., et al. The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation. Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).
- Hatley, M. E., et al. A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage. Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).
- Drummond, C. J., et al. Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors. Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).
- Almazan-Moga, A., et al. Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma. Stem Cells International. , (2017).
- Walter, D., et al. CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Ciccarelli, C., et al. Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population. Molecular Cancer. 15, (2016).
- Deel, M. D., et al. The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).
- Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy. Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).
- Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).
- Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).
- Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. In vitro Tumorsphere Formation Assays. Bio-Protocol. 3 (3), (2013).
- Zhu, Z. W., et al. A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers. Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).
- Takahashi, S. Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications. Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).
- Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation. Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).
- Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells. Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197 (4302), 461-463 (1977).
- Hamburger, A. W. The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology. The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).
- Jimenez-Hernandez, L. E., et al. NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties. Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Salerno, M., et al. Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas. International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).
