והטיפול מתאי הגידול הראשוניים מבודדים מעכבר תמס שריר
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה המיומנת לבידוד של תאים ראשוניים של העכבר השרירים, היווצרות tumorsphere וטיפול, השתלת השתלת החל בתרבויות tumorsphere.
Abstract
הרדויוסרקומה (RMS) הוא סרקומה רקמת רך השכיח ביותר אצל ילדים. למרות מאמצים משמעותיים אפשרו זיהוי של מוטציות נפוצות הקשורות RMS ומותר אפליה של תתי סוגים שונים, האתגרים העיקריים עדיין קיימים לפיתוח של טיפולים חדשניים כדי לשפר עוד יותר פרוגנוזה. למרות שהוא מזוהה על ידי הביטוי של סמנים מיוגניים, יש עדיין מחלוקת משמעותית על האם RMS יש מקורות או לא מזוגניים, כמו תא המוצא עדיין מובן בצורה גרועה. במהלך המחקר הנוכחי, שיטה אמינה מסופקת עבור הספק הטמורספירה עבור העכבר RMS. המנה מבוססת על תכונות פונקציונליות של תאים סרטניים ומאפשרת זיהוי של אוכלוסיות נדירות בגידול עם פונקציות tuמוריגניים. מתוארים גם הליכים עבור בדיקות רקומביננטי חלבונים, שילוב פרוטוקולי החצייה עם שיטת tumorsphere, והערכת גנים המועמדים המעורבים בפיתוח וצמיחה הגידול. תיאר עוד הוא הליך השתלת השתלת של tumorspheres לתוך עכברי הנמען כדי לאמת את הפונקציהtumorspheres ב vivo. באופן כללי, השיטה המתוארת מאפשרת זיהוי ובדיקה אמינים של אוכלוסיות מתוגני מחלות מחלות שניתן להחילם על RMS העולות בהקשרים שונים. לבסוף, הפרוטוקול יכול להיות מנוצל כפלטפורמה עבור הקרנת סמים ופיתוח עתידי של therapeutics.
Introduction
סרטן היא מחלה הטרוגנית; יתר על כן, אותו סוג של גידול יכול להציג מוטציות גנטיות שונות בחולים שונים, ובתוך החולה גידול מורכב על ידי אוכלוסיות מרובות של תאים1. טרוגניות מציג אתגר בזיהוי של תאים האחראים על ייזום והפצת סרטן, אבל האפיון שלהם חיוני לפיתוח של טיפולים יעילים. הרעיון של הגידול תאים הפצת (TPC), אוכלוסייה נדירה של תאים שתורמים להתפתחות הגידול, כבר נבדקו בעבר בהרחבה2. למרות העובדה tpcs התאפיין בסוגים מרובים של סרטן, זיהוי של סמנים עבור בידוד אמין שלהם נשאר אתגר עבור מספר סוגי גידולים3,4,5,6 , מיכל סבן , בן שמונה , 9. Thus, שיטה שאינה נשענת על סמנים מולקולריים אלא על תכונות פונקציונליות tpc (התחדשות עצמית גבוהה ויכולת לצמוח בתנאים בעלי קבצים מצורפים נמוכים), המכונה שיטת היווצרות tumorsphere, ניתן להחיל נרחב על ה זיהוי של TPCs מרוב הגידולים. חשוב מכך, שיטת הפעולה יכולה גם להיות מועסק להרחבת tpcs ובכך להחיל ישירות על הקרנת תרופות לסרטן ומחקרים על התנגדות לסרטן1,10.
הרדויוסרקומה (RMS) היא צורה נדירה של סרקומה של רקמה רכה הנפוצה ביותר בילדים צעירים11. לאחר ההערכה ניתן לזהות היסטולוגית באמצעות הערכת הביטוי של סמנים מיוגניים, תא RMS של המקור לא כבר univocally מאופיין בשל תת הסרטניים מרובים טרוגניות גבוהה של גירויים התפתחותיים הגידול. ואכן, מחקרים שנעשו לאחרונה יצרו דיון מדעי משמעותי על האם rms הוא של מקורות מיוגניים או לא מיוגניים, הרומז כי rms עשוי לנבוע מסוגי תאים שונים בהתאם להקשר12,13, מיכל בן 14 , מיכל בן 15 , מיכל בן 16 , 17. מחקרים רבים על קווי התאים של RMS בוצעו באמצעות שיטת היווצרות tumorsphere לזיהוי של מסלולים מעורבים בפיתוח הגידול ואפיון של סמנים הקשורים לאוכלוסיות התחדשות עצמית מאוד מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , . עשריםואחד
עם זאת, למרות היכולת של היווצרות הצורה tumorsphere לזיהוי תאי RMS של המקור, שיטה אמינה שניתן ליישם בתאי RMS ראשוניים עדיין לא תוארה. בהקשר זה, מחקר שנערך לאחרונה מהקבוצה שלנו מועסקים שיטת היווצרות ממוטבת tumorsphere לזיהוי של תאי RMS המקור ב ניוון שרירים Duchenne (DMD) העכבר מודל22. סוגים מרובים של תא מראש, מבודדים מרקמות שרירים, נבדקים על יכולתם לצמוח בתנאים מצורפים נמוכה, המאפשר זיהוי של תאי גזע שריר כמו תאים של מוצא RMS בהקשרים הדיסטרומכולה. מתואר כאן הוא פרוטוקול מהימן ואמין עבור שיטת היווצרות tumorsphere (איור 1), אשר הועסק בהצלחה לזיהוי של אוכלוסיות תאים נדירים ביותר האחראים לפיתוח העכבר RMS.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטות מרובות מועסקים לבידוד ואפיון של TPCs מן הגידול אוכלוסיות תאים הטרוגנית: הגידול clonogenic assays, בידוד FACS, ו-tumorsphere שיטת היווצרות. שיטת הגידול clonogenic תוארה לראשונה ב 1971, משמש ללימודי תאי גזע, ורק לאחר מכן להחיל על הביולוגיה סרטן29,30. שיטה זו מבוססת על תאי גזע סרטן ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענק אליסון הקרן רפואי המענק AG-NS-0843-11, ואת מענק הפיילוט NIH בתוך מרכז הסרטן NCI תמיכה גרנט P30CA030199. ס. י.
Materials
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin – Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
References
- Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
- Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea–a paradigm shift. Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. Molecular biology of liver cancer stem cells. Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).
- Crous, A. M., Abrahamse, H. Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy. Stem Cell Research & Therapy. 4 (5), 129 (2013).
- Tomao, F., et al. Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells. Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).
- Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease. Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).
- Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods. Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
- Lee, C. -. H., Yu, C. -. C., Wang, B. -. Y., Chang, W. -. W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).
- Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program. Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).
- Blum, J. M., et al. Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells. Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).
- Rubin, B. P., et al. Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).
- Keller, C., et al. Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity. of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes & Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).
- Tremblay, A. M., et al. The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation. Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).
- Hatley, M. E., et al. A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage. Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).
- Drummond, C. J., et al. Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors. Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).
- Almazan-Moga, A., et al. Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma. Stem Cells International. , (2017).
- Walter, D., et al. CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Ciccarelli, C., et al. Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population. Molecular Cancer. 15, (2016).
- Deel, M. D., et al. The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).
- Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy. Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).
- Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).
- Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).
- Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. In vitro Tumorsphere Formation Assays. Bio-Protocol. 3 (3), (2013).
- Zhu, Z. W., et al. A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers. Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).
- Takahashi, S. Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications. Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).
- Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation. Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).
- Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells. Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197 (4302), 461-463 (1977).
- Hamburger, A. W. The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology. The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).
- Jimenez-Hernandez, L. E., et al. NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties. Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Salerno, M., et al. Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas. International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).
