Derivação e tratamento de tumorsphere de células tumorais primárias isoladas de rabdomiossarcoma de camundongo
Summary
Este protocolo descreve um método reprodutível para a isolação de pilhas preliminares do rabdomiossarcoma do rato, da formação e do tratamento do tumorsphere, e da transplantação do aloenxerto que partem das culturas dos tumorspheres.
Abstract
O rhabdomyosarcoma (RMS) é o sarcoma macio o mais comum do tecido nas crianças. Embora esforços significativos permitiram a identificação de mutações comuns associadas ao RMS e permitiram a discriminação de diferentes subtipos de RMS, ainda existem grandes desafios para o desenvolvimento de novos tratamentos para melhorar ainda mais o prognóstico. Embora identificada pela expressão de marcadores miogênicos, ainda há controvérsia significativa sobre se o RMS tem origens miogênicas ou não miogênicas, já que a célula de origem ainda é pouco compreendida. No presente estudo, um método confiável é fornecido para o ensaio de tumorfera para o mouse RMS. O ensaio é baseado em propriedades funcionais de pilhas do tumor e permite a identificação de populações raras no tumor com funções tumorigênico. Também são descritos procedimentos para testar proteínas recombinantes, integrando protocolos de transfecção com o ensaio de tumorfera e avaliando genes candidatos envolvidos no desenvolvimento e crescimento tumoral. Descrito mais é um procedimento para a transplantação do aloenxerto de tumorspheres em ratos destinatários para validar a função tumorigênico in vivo. Globalmente, o método descrito permite a identificação e o teste confiáveis de populações tumorigênicas de RMS raras que podem ser aplicadas a RMS que surgem em diferentes contextos. Finalmente, o protocolo pode ser utilizado como plataforma para triagem de fármacos e desenvolvimento futuro da terapêutica.
Introduction
O câncer é uma doença heterogênea; Além disso, o mesmo tipo de tumor pode apresentar mutações genéticas diferentes em pacientes diferentes, e dentro de um paciente um tumor é compor por populações múltiplas das pilhas1. A heterogeneidade apresenta um desafio na identificação de células responsáveis pelo início e propagação do câncer, mas sua caracterização é essencial para o desenvolvimento de tratamentos eficientes. A noção de pilhas de propagação do tumor (TPC), uma população rara das pilhas que contribuem ao desenvolvimento do tumor, foi revista previamente extensivamente2. Apesar do fato de que os TPCs têm sido caracterizados em múltiplos tipos de câncer, a identificação de marcadores para seu isolamento confiável continua sendo um desafio para vários tipos de tumores3,4,5,6 , 7 anos de , 8 . º , 9. assim, um método que não dependa de marcadores moleculares, mas em propriedades funcionais de TPC (alta autorenovação e a capacidade de crescer em condições de baixa fixação), conhecido como o ensaio de formação de tumorfera, pode ser amplamente aplicado para o identificação de TPCs da maioria dos tumores. Importante, este ensaio também pode ser empregado para a expansão de TPCs e, portanto, aplicado diretamente à triagem de drogas de câncer e estudos sobre a resistência ao câncer1,10.
O rabdomiossarcoma (RMS) é uma forma rara de sarcoma de tecido mole mais comum em crianças jovens11. Althoug RMS pode ser identificado histologicamente através da avaliação da expressão de marcadores miogênicos, a célula RMS de origem não foi caracterizada univocalmente devido aos subtipos de tumores múltiplos e alta heterogeneidade dos estímulos de desenvolvimento tumoral. De fato, estudos recentes têm gerado uma discussão científica significativa sobre se o RMS é de origem miogênica ou não-miogênica, sugerindo que o RMS pode derivar de diferentestipos decélulas, dependendodo contexto12,13, 14 anos de , 15 anos de , 16 anos de , 17. numerosos estudos sobre as linhagens de células RMS foram realizados empregando o ensaio de formação de tumorfera para a identificação de vias envolvidas no desenvolvimento tumoral e caracterização de marcadores associados a populações de alta autorenovação 18 anos de , 19 anos de , 20 anos de , a 21.
Entretanto, apesar do potencial do ensaio de formação da tumorfera para identificar as células de origem do RMS, um método confiável que pode ser empregado em células RMS primárias ainda não foi descrito. Neste contexto, um estudo recente de nosso grupo empregou um ensaio otimizado de formação de tumorfera para a identificação das células de origem do RMS em um modelo de rato de distrofia muscular de Duchenne (DMD)22. Vários tipos de células pré-tumorigênicas, isolados de tecidos musculares, são testados por sua capacidade de crescer em condições de baixo apego, permitindo a identificação de células-tronco musculares como células de origem para RMS em contextos distróficos. Descrito aqui é um protocolo reprodutível e confiável para o ensaio de formação de tumorfera (Figura 1), que tem sido empregado com sucesso para a identificação de populações de células extremamente raras que são responsáveis pelo desenvolvimento do mouse RMS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos múltiplos foram empregados para a isolação e a caracterização dos TPCs das populações heterogêneas da pilha do tumor: ensaios ensaios do tumor, isolação de FACS, e ensaio da formação do tumorsphere. O ensaio clonogénico do tumor foi descrito primeiramente em 1971, usado para estudos da pilha de haste, e aplicado somente subseqüentemente à biologia do cancer29,30. Este método é baseado na propriedade intrínseca das pilhas de haste do …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela concessão AG-NS-0843-11 da Fundação médica de Ellison, e pelo Grant piloto de NIH dentro da concessão do apoio do centro do cancer de NCI P30CA030199 a A.S.
Materials
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin – Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
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