Summary

マウス横紋筋肉腫から単離された原発性腫瘍細胞からの腫瘍球誘導と治療

Published: September 13, 2019
doi:

Summary

このプロトコルは、マウス横紋筋肉腫原発細胞の単離、腫瘍球形成および治療、および腫瘍球培養から始まる同種移植片移植のための再現可能な方法を説明する。

Abstract

横紋筋肉腫(RMS)は、小児で最も一般的な軟部組織肉腫である。RMSに関連する一般的な変異の同定を可能にし、異なるRMSサブタイプの判別を可能にする多大な努力がなされたが、予後をさらに改善するための新しい治療法の開発には大きな課題が依然として存在する。筋原性マーカーの発現によって同定されるが、RMSが筋原性または非筋原起源を有するかどうかについては、起源の細胞がまだ十分に理解されていないため、依然として重大な論争がある。本研究では、マウスRMSに対する腫瘍球アッセイに対して信頼性の高い方法が提供される。アッセイは腫瘍細胞の機能特性に基づいており、腫瘍機能を有する腫瘍中の稀な集団の同定を可能にする。また、組換えタンパク質の検査、トランスフェクションプロトコルと腫瘍球アッセイの統合、腫瘍の発達および増殖に関与する候補遺伝子の評価の手順についても説明します。さらに説明する、生体内で腫瘍属機能を検証するレシピエントマウスへの腫瘍球の同種移植移植の手順である。全体的に、記載された方法は、異なる文脈で生じるRMSに適用することができる希少なRMS腫瘍属集団の信頼性の高い同定および試験を可能にする。最後に、このプロトコルは、薬物スクリーニングおよび治療の将来の開発のためのプラットフォームとして利用することができる。

Introduction

癌は不均一な病気です。さらに、同じタイプの腫瘍は、異なる患者に異なる遺伝子変異を提示することができ、患者内で腫瘍は細胞1の複数の集団によって構成される。異種性は、がんの発症と伝播を担う細胞の同定に課題を提示しますが、効率的な治療法の開発にはその特徴付けが不可欠です。腫瘍伝播細胞(TPC)の概念は、腫瘍の発達に寄与する稀な細胞集団であり、以前に広範囲に見直された2.TPCは複数のタイプの癌で特徴付けられてきたにもかかわらず、信頼性の高い単離のためのマーカーの同定は、いくつかの腫瘍タイプ3、4、5、6のための挑戦のままである,7,8,9.したがって、分子マーカーに依存せず、むしろTPC機能特性(高い自己再生および低アタッチメント条件下で成長する能力)に依存しない方法は、腫瘍球形成アッセイとして知られており、ほとんどの腫瘍からのTPCの同定。重要なことに、このアッセイはTPCの拡大にも用いられ、したがって癌薬物スクリーニングおよび癌耐性1、10に関する研究に直接適用することができる。

横紋筋肉腫(RMS)は、幼児11で最も一般的な軟部組織肉腫のまれな形態である。Althoug RMSは、筋原性マーカーの発現の評価を通じて組織学的に同定することができ、起源のRMS細胞は、腫瘍発達刺激の複数の腫瘍サブタイプおよび高い不均一性のために単元的に特徴付けられていない。実際、最近の研究では、RMSが筋原性または非筋原起源のどちらであるかに関する重要な科学的議論が生じ、RMSは文脈12、13に応じて異なる細胞タイプから派生する可能性があることを示唆している。14歳,15歳,16歳,17.RMS細胞株に関する多数の研究は、腫瘍の発達に関与する経路の同定および高度自己再生集団に関連するマーカーの特徴付けのための腫瘍球形成アッセイを用いて行われている。18歳,19歳,20歳,21.

しかしながら、発産元のRMS細胞を同定する腫瘍球形成アッセイの可能性にもかかわらず、一次RMS細胞に用いることができる信頼性の高い方法はまだ説明されていない。この文脈において、我々のグループからの最近の研究は、デュシェンヌ筋ジストロフィー(DMD)マウスモデル22における起源のRMS細胞の同定のための最適化された腫瘍球形成アッセイを採用した。筋肉組織から単離された複数の腫瘍形成前細胞型は、低アタッチメント条件で増殖する能力について試験され、ジストロフィー性コンテキストにおけるRMSの起源細胞としての筋肉幹細胞の同定を可能にする。ここで説明する腫瘍球形成アッセイ(図1)の再現性と信頼性の高いプロトコルは、マウスRMS開発を担う極めて稀な細胞集団の同定に成功している。

Protocol

マウスのハウジング、治療、および犠牲は、サンフォードバーナム・プレビーズ医学発見研究所の承認されたIACUCプロトコルに従って行われた。 1. 試薬の調製 100 mLの細胞単離培地を調記:F10培地に10%の馬血清(HS)を補充した。 50mLのコラゲナーゼ型II溶液を調製する:50mLの細胞単離培地にコラゲナーゼ型II粉末を1g溶解させる(ロットによって単位数が異なるた?…

Representative Results

腫瘍球検出細胞単離は、腫瘍組織に存在する細胞集団の最大不均一性を得るために最適化された。まず、単離された組織は形態的に異なる領域を提示するので、均一な希少細胞集団を単離する可能性を高めるために、腫瘍の複数の領域からサンプリングを行った(図1A、左の第1パネル)。第二に、採取したサンプルの機械的解離は?…

Discussion

腫瘍異種細胞集団からのTPCの単離および特性解析には、腫瘍クロノゲンアッセイ、FACS単離、腫瘍球形成アッセイなど、複数の方法が採用されています。腫瘍クロノジェニックアッセイは、1971年に最初に記載され、幹細胞研究に用いられ、その後癌生物学29,30にのみ適用された。この方法は、がん幹細胞本体性に基づいて、軟式ゲル培?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、エリソン医療財団助成金AG-NS-0843-11とNCIがんセンターサポート助成金P30CA030199内のNIHパイロット助成金によってA.S.に支援されました。

Materials

Accutase cell dissociation reagent Gibco A1110501 Detach adherent cells and dissociate tumorspheres
Celigo Nexcelom Celigo Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells
Collagenase, Type II Life Technologies 17101015 Tissue digestion enzyme
Dispase II, protease Life Technologies 17105041 Tissue digestion enzyme
DMEM high glucose media Gibco 11965092 Component of tumor cells media
DMEM/F12 Media Gibco 11320033 Component of tumosphere media
EDTA ThermoFisher S312500 Component of FACS buffer
EGF recombinant mouse protein Gibco PMG8041 Component of tumosphere media
FACSAria II Flow Cytometry BD Biosciences 650033 Fluorescent activated cell sorter
Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-11 Component of tumor cells media
Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent MWI Vet Supply 502017 Anesthetic reagent for animals
FxCycle Violet Stain Life Technologies F10347 Discriminate live and dead cells
Goat Serum Life Technologies 16210072 Component of FACS buffer
Ham's F10 Media Life Technologies 11550043 Component of FACS buffer
Horse Serum Life Technologies 16050114 Component of cell isolation media
Lipofectamine 3000 transfection reagent ThermoFisher L3000015 Transfection Reagent
Matrigel membrane matrix Corning CB40234 Provides support to trasplanted cells
N-2 Supplemtns (100X) Gibco 17502048 Component of tumosphere media
Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment MWI Vet Supply 701008 Eyes ointment
PBS Gibco 10010023 Component of FACS buffer and used for washing cells
pEGFP-C1 Addgene 6084-1 GFP plasmid
Penicillin – Streptomyocin Life Technologies 15140163 Component of tumosphere and tumor cells media
Recombinant Human βFGF-basic Peprotech 10018B Component of tumosphere media
Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein R&D Systems 427-FL-005 Recombinant protein
Trypan blue ThermoFisher 15250061 Discriminate live and dead cells

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Cite This Article
Boscolo Sesillo, F., Sacco, A. Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas. J. Vis. Exp. (151), e59897, doi:10.3791/59897 (2019).

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