このプロトコルは、マウス横紋筋肉腫原発細胞の単離、腫瘍球形成および治療、および腫瘍球培養から始まる同種移植片移植のための再現可能な方法を説明する。
横紋筋肉腫(RMS)は、小児で最も一般的な軟部組織肉腫である。RMSに関連する一般的な変異の同定を可能にし、異なるRMSサブタイプの判別を可能にする多大な努力がなされたが、予後をさらに改善するための新しい治療法の開発には大きな課題が依然として存在する。筋原性マーカーの発現によって同定されるが、RMSが筋原性または非筋原起源を有するかどうかについては、起源の細胞がまだ十分に理解されていないため、依然として重大な論争がある。本研究では、マウスRMSに対する腫瘍球アッセイに対して信頼性の高い方法が提供される。アッセイは腫瘍細胞の機能特性に基づいており、腫瘍機能を有する腫瘍中の稀な集団の同定を可能にする。また、組換えタンパク質の検査、トランスフェクションプロトコルと腫瘍球アッセイの統合、腫瘍の発達および増殖に関与する候補遺伝子の評価の手順についても説明します。さらに説明する、生体内で腫瘍属機能を検証するレシピエントマウスへの腫瘍球の同種移植移植の手順である。全体的に、記載された方法は、異なる文脈で生じるRMSに適用することができる希少なRMS腫瘍属集団の信頼性の高い同定および試験を可能にする。最後に、このプロトコルは、薬物スクリーニングおよび治療の将来の開発のためのプラットフォームとして利用することができる。
癌は不均一な病気です。さらに、同じタイプの腫瘍は、異なる患者に異なる遺伝子変異を提示することができ、患者内で腫瘍は細胞1の複数の集団によって構成される。異種性は、がんの発症と伝播を担う細胞の同定に課題を提示しますが、効率的な治療法の開発にはその特徴付けが不可欠です。腫瘍伝播細胞(TPC)の概念は、腫瘍の発達に寄与する稀な細胞集団であり、以前に広範囲に見直された2.TPCは複数のタイプの癌で特徴付けられてきたにもかかわらず、信頼性の高い単離のためのマーカーの同定は、いくつかの腫瘍タイプ3、4、5、6のための挑戦のままである,7,8,9.したがって、分子マーカーに依存せず、むしろTPC機能特性(高い自己再生および低アタッチメント条件下で成長する能力)に依存しない方法は、腫瘍球形成アッセイとして知られており、ほとんどの腫瘍からのTPCの同定。重要なことに、このアッセイはTPCの拡大にも用いられ、したがって癌薬物スクリーニングおよび癌耐性1、10に関する研究に直接適用することができる。
横紋筋肉腫(RMS)は、幼児11で最も一般的な軟部組織肉腫のまれな形態である。Althoug RMSは、筋原性マーカーの発現の評価を通じて組織学的に同定することができ、起源のRMS細胞は、腫瘍発達刺激の複数の腫瘍サブタイプおよび高い不均一性のために単元的に特徴付けられていない。実際、最近の研究では、RMSが筋原性または非筋原起源のどちらであるかに関する重要な科学的議論が生じ、RMSは文脈12、13に応じて異なる細胞タイプから派生する可能性があることを示唆している。14歳,15歳,16歳,17.RMS細胞株に関する多数の研究は、腫瘍の発達に関与する経路の同定および高度自己再生集団に関連するマーカーの特徴付けのための腫瘍球形成アッセイを用いて行われている。18歳,19歳,20歳,21.
しかしながら、発産元のRMS細胞を同定する腫瘍球形成アッセイの可能性にもかかわらず、一次RMS細胞に用いることができる信頼性の高い方法はまだ説明されていない。この文脈において、我々のグループからの最近の研究は、デュシェンヌ筋ジストロフィー(DMD)マウスモデル22における起源のRMS細胞の同定のための最適化された腫瘍球形成アッセイを採用した。筋肉組織から単離された複数の腫瘍形成前細胞型は、低アタッチメント条件で増殖する能力について試験され、ジストロフィー性コンテキストにおけるRMSの起源細胞としての筋肉幹細胞の同定を可能にする。ここで説明する腫瘍球形成アッセイ(図1)の再現性と信頼性の高いプロトコルは、マウスRMS開発を担う極めて稀な細胞集団の同定に成功している。
腫瘍異種細胞集団からのTPCの単離および特性解析には、腫瘍クロノゲンアッセイ、FACS単離、腫瘍球形成アッセイなど、複数の方法が採用されています。腫瘍クロノジェニックアッセイは、1971年に最初に記載され、幹細胞研究に用いられ、その後癌生物学29,30にのみ適用された。この方法は、がん幹細胞本体性に基づいて、軟式ゲル培?…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、エリソン医療財団助成金AG-NS-0843-11とNCIがんセンターサポート助成金P30CA030199内のNIHパイロット助成金によってA.S.に支援されました。
Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
Penicillin – Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |