Dérivation et traitement de la tumorale à partir de cellules tumorales primaires isolées de la souris Rhabdomyosarcomas
Summary
Ce protocole décrit une méthode reproductible pour l’isolement des cellules primaires de rhabdomyosarcoma de souris, de la formation et du traitement de la tumorsphere, et de la transplantation d’allogreffe commençant des cultures de tumorspheres.
Abstract
Le rhabdomyosarcome (RMS) est le sarcome des tissus mous le plus courant chez les enfants. Bien que des efforts significatifs aient permis l’identification des mutations communes associées au RMS et aient permis la discrimination de différents sous-types de RMS, des défis majeurs existent toujours pour le développement de nouveaux traitements pour améliorer davantage le pronostic. Bien qu’identifié par l’expression des marqueurs myogéniques, il y a encore une controverse significative quant à savoir si RMS a des origines myogéniques ou non myogéniques, car la cellule d’origine est encore mal comprise. Dans la présente étude, une méthode fiable est fournie pour l’analyse de la tumorsphere pour la souris RMS. L’analyse est basée sur les propriétés fonctionnelles des cellules tumorales et permet l’identification de populations rares dans la tumeur avec des fonctions tumorigènes. On décrit également des procédures pour tester des protéines recombinantes, intégrant des protocoles de transfection avec l’essai de la tumorsphere, et évaluant des gènes candidats impliqués dans le développement et la croissance de tumeur. Décrit en outre est une procédure pour la transplantation allogreffe de tumorspheres dans les souris destinataires pour valider la fonction tumorigenic in vivo. Dans l’ensemble, la méthode décrite permet l’identification et l’essai fiables des populations tumorigenic rares de RMS qui peuvent être appliquées au RMS surgissant dans différents contextes. Enfin, le protocole peut être utilisé comme une plate-forme pour le dépistage des médicaments et le développement futur de la thérapeutique.
Introduction
Le cancer est une maladie hétérogène; en outre, le même type de tumeur peut présenter différentes mutations génétiques dans différents patients, et dans un patient une tumeur est composée par des populations multiples des cellules1. L’hétérogénéité présente un défi dans l’identification des cellules responsables de l’initiation et de la propagation du cancer, mais leur caractérisation est essentielle au développement de traitements efficaces. La notion des cellules de propagation de tumeur (TPC), une population rare de cellules qui contribuent au développement de tumeur, a été précédemment examiné intensivement2. Malgré le fait que les TPC ont été caractérisés dans plusieurs types de cancer, l’identification des marqueurs pour leur isolement fiable demeure un défi pour plusieurs types de tumeur3,4,5,6 , 7 Annonces , 8 Annonces , 9 . Ainsi, une méthode qui ne repose pas sur des marqueurs moléculaires, mais plutôt sur des propriétés fonctionnelles du PTC(renouvellement élevé et capacité de croître dans des conditions de faible attachement), connue sous le nom d’analyse de formation de la tumorsphere, peut être largement appliquée pour le l’identification des TPC de la plupart des tumeurs. Fait important, cet analyse peut également être utilisé pour l’expansion des TPC et donc directement appliqué au dépistage des médicaments contre le cancer et des études sur la résistance au cancer1,10.
Le rhabdomyosarcome (RMS) est une forme rare de sarcome des tissus mous le plus fréquent chez les jeunes enfants11. Althoug RMS peut être histologiquement identifié par l’évaluation de l’expression des marqueurs myogéniques, la cellule d’origine de RMS n’a pas été unvocally caractérisée en raison des sous-types multiples de tumeur et de l’hétérogénéité élevée des stimulus développementals de tumeur. En effet, des études récentes ont suscité une discussion scientifique importante sur la question de savoir si le RMS est d’origine myogène ou non myogénique, suggérant que le RMS peut provenir de différents types de cellules selon le contexte12,13, 14 (en) , 15 Annonces , 16 Annonces , 17. De nombreuses études sur les lignées cellulaires rmS ont été réalisées en utilisant l’exemple de formation de la tumorsphère pour l’identification des voies impliquées dans le développement tumoral et la caractérisation des marqueurs associés à des populations fortement auto-renouveau 18 ans, états-unis qui , 19 ans, états-unis qui , 20 Ans, états-unis , 21.
Cependant, en dépit du potentiel d’analyse de formation de tumorsphere pour identifier des cellules de RMS d’origine, une méthode fiable qui peut être employée sur les cellules primaires de RMS n’a pas encore été décrite. Dans ce contexte, une étude récente de notre groupe a utilisé un test optimisé de formation de tumorsphere pour l’identification des cellules rmS d’origine dans un modèle de souris de dystrophie musculaire de Duchenne (DMD)22. Plusieurs types de cellules prétumorigènes, isolés des tissus musculaires, sont testés pour leur capacité à se développer dans des conditions de faible attachement, permettant l’identification des cellules souches musculaires comme cellules d’origine pour RMS dans des contextes dystrophiques. Décrit ici est un protocole reproductible et fiable pour l’analyse de formation de la tumorsphère (Figure 1), qui a été utilisé avec succès pour l’identification des populations cellulaires extrêmement rares qui sont responsables du développement de la souris RMS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des méthodes multiples ont été employées pour l’isolement et la caractérisation des TPC des populations hétérogènes de cellules de tumeur : essais clonogènes de tumeur, isolement de FACS, et analyse de formation de tumorsphere. L’exemple clonogène de tumeur a été décrit la première fois en 1971, employé pour des études de cellules souches, et seulement plus tard appliqué à la biologie de cancer29,30. Cette méthode est basée sur la propriété …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention ag-NS-0843-11 de la Ellison Medical Foundation et par la subvention pilote des NIH au sein de la subvention de soutien du Centre de cancérologie de l’INC P30CA030199 à A.S.
Materials
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin – Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
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