Valutazione della disponibilità di minerali nei mangimi per pesci utilizzando metodi complementari dimostrati con l'esempio di zinco nel salmone atlantico

La prova di alimentazione nella sezione 4 è stata eseguita secondo la legislazione norvegese (FOR-2015-06 – 18-761) ed europea (direttiva 2010/63/UE). 1. Valutazione delle specie chimiche Zn nella frazione solubile di un mangime per salmone atlantico utilizzando un metodo SEC-ICP-MS Tampone di estrazione (100 mM Tris-HCl, pH 8,5) Preparare il tampone di estrazione sciogliendo una quantità appropriata di tris(idrossimetil)amminometano per raggiungere la forza ionica desiderata (100 mM) in ultrapuro H2O. Regolare il pH della soluzione a pH 8,5 con la soluzione HCl, monitorando la variazione di pH con un pHmetro. Preparazione di campioni di mangimiNOTA: Il campione di mangime utilizzato è stato formulato sulla base di mangimi commerciali per salmone atlantico, contenenti fonti proteiche principalmente da ingredienti di origine vegetale (vale a.l.i., circa il 5% di proteine di pesce, il 10% di olio di pesce, il 68% di proteine vegetali e il 12% di olio vegetale). Il solfato di zinco è stato integrato al mangime. Macinare il campione di mangime a mano usando un pestello e un mortaio. Setacciare il campione di mangime per assicurarsi che l’estrazione venga eseguita in una frazione di mangime con particelle di dimensioni simili (da 850 μm a 1,12 mm). Procedere all’esecuzione dell’estrazione Zn. Estrazione dello zinco da un campione di mangime Pesare circa 0,5 g di mangime in triplice copia in tubi conici da 15 ml. Aggiungere il tampone di estrazione (5 mL di 100 mM Tris-HCl, pH 8,5) ai campioni. Estrarre i campioni in un rotatore (20 giri/min) a 4 °C per 24 ore. Separare le frazioni solubili e non solubili mediante centrifugazione per 10 min a 3000 x g. Utilizzare un filtro a siringa monouso da 0,45 μm per filtrare la frazione solubile. Trasferire i campioni filtrati in tubi puliti. Eseguire l’analisi di speciazione Zn nelle frazioni solubili utilizzando SEC-ICP-MS, come descritto nel passaggio 1.6.NOTA: un riepilogo della procedura per l’estrazione di Zn da un campione di mangime è descritto nella Figura 2. Soluzione in fase mobile (50 mM Tris-HCl + 3% MeOH, pH 7,5) Preparare la soluzione in fase mobile sciogliendo 6,057 g di tris(idrossimetil)amminometano in 1 L di soluzione di MeOH al 3% (v/v). Regolare il pH della soluzione a pH a 7,5 con la soluzione HCl, monitorando la variazione di pH con un pHmetro. Filtrare la soluzione in fase mobile attraverso un filtro a membrana da 0,45 μm. Calibrazione del peso molecolare dell’intervallo di separazione delle colonne SEC Calibrare l’intervallo di separazione eseguendo una calibrazione del peso molecolare.NOTA: In questo studio sono stati utilizzati tireoglobulina (660 kDa), superossido dismutasi Zn/Cu (32 kDa), mioglobina (17 kDa) e vitamina B12 (1,36 kDa). Preparare ciascuno degli standard con una concentrazione nota in ultrapuro H2O. Preparare un flaconcino per cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) aggiungendo 250 μL di standard a un flaconcino. Caricare i flaconcini con gli standard per l’esecuzione della sequenza dei campioni. Eseguire la calibrazione del peso molecolare all’inizio e alla fine della sequenza analitica, monitorando 127I (tireoglobulina), 66Zn (superossido dismutasi Zn/Cu), 57Fe (mioglobina) e 59Co (vitamina B12).NOTA: La calibrazione del peso molecolare viene eseguita contemporaneamente all’analisi di speciazione Zn. Analisi della speciazione dello zinco mediante SEC-ICP-MSNOTA: L’analisi di speciazione Zn con il metodo SEC-ICP-MS è stata sviluppata sulla base dei principi descritti altrove10,11 ed è stata eseguita un’ulteriore ottimizzazione per l’analisi di un mangime per salmone atlantico7. Eseguire l’analisi di speciazione Zn sulle frazioni solubili utilizzando una colonna di cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) e un HPLC accoppiato con spettroscopia di massa plasmatica accoppiata induttivamente (ICP-MS). Preparare un flaconcino HPLC aggiungendo 250 μL di frazione solubile a un flaconcino. Prima dell’analisi, picchia tutti i campioni con 0,5 μL di vitamina B12. Questo passaggio consente di correggere i tempi di ritenzione dei turni, monitorando 59Co. Diluire la frazione solubile con tampone di estrazione (100 mM Tris-HCl, pH 8,5) e regolare fino a un volume finale di 1 mL. Preparare l’esecuzione della sequenza dei campioni in ordine casuale. Sintonizzare l’ICP-MS in base alle istruzioni del produttore. Seguire le impostazioni dello strumento per l’HPLC e l’ICP-MS eseguendo l’analisi di speciazione Zn (vedere Tabella 1). 2. Solubilità in vitro dello Zn integrato nei mangimi per salmone atlantico NOTA: Il campione di mangime utilizzato è stato formulato sulla base di mangimi commerciali per salmone dell’Atlantico, contenenti fonti proteiche principalmente da ingredienti di origine vegetale (cioè circa il 5% di farina di pesce, il 10% di olio di pesce, il 68% di ingredienti vegetali e il 12% di olio vegetale). Macinare i campioni di mangime per salmone atlantico per 10 s a 3000 giri / min utilizzando un coltellificio e conservare a 4 ° C fino a ulteriori analisi. Pesare ~ 0,2 g dei campioni di mangime macinati nel passaggio 2.1 e aggiungere il radiotracciante Zn (65Zn) di attività specifica nota in una provetta di 5 mL di volume (con un tappo).ATTENZIONE: questa procedura deve essere eseguita all’interno di una suite di radionuclidi. La persona che esegue questo passaggio deve essere addestrata e certificata per gestire gli isotopi radio. Le misure di sicurezza e precauzionali consigliate dall’amministrazione per la sicurezza delle radiazioni dell’istituto devono essere rigorosamente seguite. Quindi preparare la soluzione tampone luminale intestinale d’acqua dolce come descritto di seguito. Per la soluzione salina A, pesare 11,65 g di NaNO3, 0,55 g di KNO3 e 0,4 g di MgSO4. Sciogliere i sali in ultrapuro H2O e regolare fino ad un volume finale di 60 ml. Per la soluzione salina B, pesare 0,31 g di Ca(NO3)2· 4 H2O. Sciogliere i sali in ultrapuro H2O e regolare fino ad un volume finale di 10 ml. Utilizzare la soluzione stock HEPES da 500 mM come soluzione salina C. Per la soluzione salina D, pesare 1,2 g di MgCl2, sciogliere il sale in ultrapuro H2O e regolare a un volume finale di 20 ml. Per la soluzione salina E, pesare 0,9 g di MgSO4, sciogliere il sale in ultrapuro H2O e regolare a un volume finale di 20 ml. Preparare la soluzione di piruvato sciogliendo 0,55 g di CH3COCOONa in 10 ml di ultrapuro H2O. Sciogliere 0,9 g di galattosio (C6H12O6) in ultrapuro H2O. Sciogliere bene con un agitatore magnetico e sterilizzare le soluzioni saline A, B, D ed E mediante autoclave e la soluzione C, piruvato e galattosio mediante filtrazione attraverso un filtro a siringa da 200 μm. Dopo la preparazione delle diverse soluzioni stock, per preparare 100 mL di soluzione di lavoro del tampone, mescolare le soluzioni preparate sopra nella seguente proporzione: 6,8 mL di soluzione salina A, 4,14 mL di B, 5 mL di C, 2,5 mL di D, 1,5 mL di E e 1,14 mL ciascuno di piruvato e galattosio. Portare il volume a 100 ml usando acqua deionizzata.NOTA: Il buffer di cui sopra rappresenterà ora la composizione ionica del lume intestinale che si trova nei salmonidi d’acqua dolce. Preparare altre sei aliquote del tampone descritte al punto 2.6 e aggiungere uno dei seguenti amminoacidi (cisteina, metionina, glicina, istidina, lisina e arginina) per raggiungere una concentrazione molare finale di 5 mM. Aggiungere il tampone luminale intestinale d’acqua dolce (volume di reazione = 3 mL; pH 7,4) al campione di mangime. Ripetere il passaggio 2.5 con i tamponi descritti al punto 2.4 (in presenza di diversi amminoacidi a 5 mM di concentrazione). Chiudere i tubi e lasciarli girare in uno spinner rotante per 30 minuti a 25 giri / min. Separare le frazioni solubili e non solubili mediante centrifugazione per 10 min a 1157 x g. Utilizzare un cassiere gamma per misurare i conteggi al minuto (cpm) di 65Zn nelle frazioni solubili e non solubili. Calcolare la proporzione dei radioi isotopi di Zn(65Zn) presenti nelle frazioni solubili e non solubili. 3. Valutazione dell’assorbimento di specie chimiche Zn utilizzando un modello intestinale in vitro (RTgutGC) Coltura di cellule RTgutGCNOTA: tutti i materiali di lavoro utilizzati in questa fase devono essere sterili. Ravvivare delicatamente le cellule RTgutGC congelate a bagnomaria a 20 °C. Pipettare delicatamente la soluzione contenente le cellule e sospenderle in 10 ml di terreno L15 contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS).NOTA: il 10% di FBS viene utilizzato solo per far rivivere le cellule congelate. Per il passaggio successivo, FBS viene utilizzato al 5%. La composizione di FBS può variare tra i lotti, quindi è consigliabile acquistare e immagazzinare quanto richiesto da un singolo lotto per evitare variazioni tra i lotti nella composizione del siero. Aggiungere la sospensione cellulare a 75 cm 2 palloni dicoltura cellulare e incubare in un incubatore impostato a 19 °C in atmosfera normale. Controllare le cellule e quando sono confluenti (confluenza dell’80%, valutare visivamente esaminando la densità della superficie cellulare al microscopio), dividere le cellule in nuovi palloni (passaggio successivo) o raccogliere da utilizzare negli esperimenti.NOTA: Un esempio delle cellule RTgutGC 1 ora e 1 settimana dopo la semina ai palloni di coltura cellulare è mostrato nella Figura 3. Raccolta cellulare e preparazione per esperimenti di esposizione Lavare le cellule due volte con 1 mL di soluzione di acido etilendiammitattraacetico (EDTA). Dopo ogni lavaggio, sifonare la soluzione di EDTA utilizzando un tubo di aspirazione sterile. Trattare le cellule con tripsina (0,7 ml di tripsina, nello 0,25% in soluzione salina tamponata con fosfato [PBS]). Ruotare delicatamente il matraccio ad angoli acuti per distribuire la tripsina lungo tutta la superficie del pallone. Continuare la rotazione per 2 minuti, mentre le celle si staccano. Dopo aver ruotato delicatamente per 2 minuti, aggiungere 10 ml di L15/FBS medium per neutralizzare la tripsina. Decantare la sospensione cellulare risultante in un tubo di centrifuga conico inferiore utilizzando una pipetta sterile e una centrifuga per 3 minuti a 130 x g. Determinare la densità delle cellule raccolte mediante il conteggio manuale utilizzando l’emocitometro. Aggiungere il volume richiesto di supporto L15/FBS per ottenere una densità di cella di 5 x 104 celle/ml. Seminare le cellule su piastre a 24 pozzi pipettando 1 mL di sospensione cellulare per pozzo per raggiungere la densità cellulare finale di 5 x 104 cellule / pozzo.NOTA: utilizzare preferibilmente pipette multi-erogazione per ridurre al minimo le variazioni e ridurre i tempi. Posizionare le piastre seminate in un’incubatrice in atmosfera normale a 19 °C per 48 ore prima degli esperimenti.NOTA: Tripsina da conservare a -20 °C; Soluzione EDTA e supporti L15/FBS a 4 °C. Regolare la temperatura di tutte le soluzioni di lavoro e dei supporti a 19 °C appena prima dell’uso. Preparazione dei mezzi di esposizione NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito sotto la cappa aspirante in condizioni asettiche e sterili. Preparare L15/ex mescolando 6,8 mL di soluzione salina A (fase 2.3.1), 1,14 mL di B (fase 2.3.2), 5 mL di C (fase 2.3.3) e 1,14 mL ciascuno di piruvato (punto 2.3.6) e galattosio (punto 2.3.7). Portare il volume a 100 ml utilizzando acqua distillata sterile per colture cellulari. Preparare FW mescolando 6,8 mL di soluzione salina A (2.3.1), 4,14 mL di B (2.3.2), 5 mL di C (2.3.3), 2.5 mL di D (2.3.4), 1.5 mL di E (2.3.5) e 1.14 mL ciascuno di piruvato (2.3.6) e galattosio (2.3.7). Portare il volume a 100 ml utilizzando acqua distillata sterile di grado di coltura cellulare. Quantificare le concentrazioni di ioni nel mezzo di esposizione utilizzando ICP-MS come descritto altrove12.NOTA: Le concentrazioni ioniche analizzate nei preparati dei mezzi sono presentate nella Tabella 2. Saggi di afflusso di zinco (65Zn) Seminare le cellule RTgutGC su piastre a 24 pozzi (5 x 104 celle/pozzo) in mezzo L15/FBS completo. Incubare per 48 ore in un incubatore con atmosfera normale a 19 °C. Regolare tutti i preparati sperimentali a pH 7,4 utilizzando 0,5 M NaOH in presenza o assenza di L-metionina (L-Met) o DL-metionina (DL-Met) a una concentrazione di 2 mM.NOTA: L’aggiustamento del pH dei tamponi descritti al punto 3.4.3 deve essere effettuato prima del trattamento delle cellule nel passaggio 3.4.5. Dopo il completamento del periodo di incubazione, rimuovere il mezzo dai pozzi e risciacquare abbondantemente con PBS. Aggiungere il mezzo sperimentale FW regolato a pH e consentire l’acclimatazione per 20 minuti. Esporre le cellule RTgutGC a concentrazioni nominali di 3,07, 6,14, 12,27 e 24,55 μM 65Zn(II) (come ZnCl2;~4 kBq/mL) nei mezzi descritti al punto 3.4.3. Subito dopo, tenere le cellule nell’incubatrice a 19 °C per 15 minuti. Al termine dell’incubazione di 15 minuti, aspirare il surnatante di coltura e rimuoverlo dal pozzo. Risciacquare le cellule con un mezzo FW ghiacciato (con 200 μM Zn, pH 7,4) e quindi spegnere aggiungendo il tampone da 5 mM di glicole etilenico-bis(β-aminoetiletiltere)-N,N,N’,N’-acido tetraacetico (EGTA) (pH 7,4) per 5 minuti, per eliminare qualsiasi 65Zn(II) adsorbito. Esporre le cellule ai preparati di cui sopra in presenza o in assenza di 10 mM 2-aminobiciclo [2.2.1] eptano-2-acido carbossilico (BCH), un inibitore del trasporto di aminoacidi. Dopo il periodo di esposizione di 15 minuti, ripetere i passaggi 3.4.8 e 3.4.9. Le cellule RtgutGC saranno aderite al fondo dei pozzezze come un monostrato. Digerire le cellule utilizzando lo 0,2% di detergente caldo al dodecil solfato di sodio (SDS) (100 μL/ pozzo).NOTA: la soluzione SDS deve essere posizionata per 1 ora in un bagno d’acqua impostato a 90 °C prima dell’uso. Aspirare e recuperare il digestato cellulare in un tubo da 1,5 ml. Misurare la radioattività dei digest cellulari utilizzando un contatore gamma.NOTA: I conteggi al minuto (cpm) devono essere corretti per il decadimento radioattivo, l’attività di fondo e sono sottoposti a calcoli specifici dell’attività seguendo le formule descritte da Glover e Hogstrand13. Per quantificare la concentrazione proteica delle cellule, omogeneizzare le cellule con 500 μL di 0,5 M NaOH. Utilizzare un kit di analisi Bradford per misurare la concentrazione proteica nel campione cellulare, con albumina sierica bovina (BSA) come standard.NOTA: Una volta quantificata la concentrazione proteica, il tasso di assorbimento di Zn da parte delle cellule RTgutGC può essere espresso come pmoles Zn min-1 mg-1 proteina. 4. Apparente disponibilità di Zn alimentare nel salmone dell’Atlantico (Salmo salar) NOTA: I mangimi per salmone atlantico sono stati formulati sulla base di mangimi commerciali, contenenti fonti proteiche principalmente da ingredienti di origine vegetale (cioè circa il 5% di proteine di pesce, il 10% di olio di pesce, il 68% di proteine vegetali e il 12% di olio vegetale). Due mangimi sono stati integrati con una fonte inorganica (solfato di Zn) o una fonte organica (chelato di Zn di glicina) per raggiungere una concentrazione di Zn di 150 mg / kg di mangime. Inoltre, l’ossido di ittrio (grado di alimentazione) è stato aggiunto al mangime allo 0,01% come marcatore inerte per consentire il calcolo del coefficiente di disponibilità apparente. Acclimatare il salmone atlantico (ceppo SalmoBreed, età 1+ anni, gruppi di sesso misto) nelle rispettive vasche fino a quando i pesci non sono abituati alle condizioni sperimentali. Valutare l’acclimatazione del salmone atlantico monitorandone l’assunzione giornaliera di mangime.NOTA: Questa prova è stata eseguita in serbatoi triplicati, quindi sono stati utilizzati un totale di sei serbatoi. Durante la prova di alimentazione la temperatura dell’acqua era di 11,9 ± 0,3 °C e la saturazione di ossigeno disciolto era del 101 ± del 5%. Nutrire il pesce con mangimi sperimentali per 11 giorni. Eutanasia del pesce per overdose usando 6 ml di soluzione stock di tricaina metanosolfonato per litro d’acqua. Raccogli un campione raggruppato di feci dal pesce dallo stesso acquario in un piatto strisciando dalla pinna ventrale all’ano. Rimuovere le feci dalla piastra con una spatola in un tubo conico da 50 ml e conservare immediatamente i campioni a -20 °C.NOTA: I campioni sono stati mantenuti a -20 °C fino a ulteriori analisi. Congelare i campioni di feci per 72 ore a -80 °C. Omogeneizzare manualmente manualmente il campione di feci in una polvere fine usando un pestello e un mortaio. Determinare la concentrazione di Zn e ittrio nei campioni di mangime e feci utilizzando un ICP-MS (come descritto altrove9). Determinare il coefficiente di disponibilità apparente (AAC, %) utilizzando la seguente formula: