تقييم توافر المعادن في أعلاف الأسماك باستخدام أساليب تكميلية موضحة مع مثال الزنك في سمك السلمون الأطلسي
Summary
يشرح هذا المقال بالتفصيل نهجا منهجيا لتقييم توافر المعادن الدقيقة في سمك السلمون الأطلسي. وتشمل المنهجية أدوات ونماذج ذات تعقيد بيولوجي متزايد: (1) تحليل التحليل الكيميائي، (2) قابلية الذوبان في المختبر، (3) دراسات امتصاص في خطوط الخلايا، و (4) في دراسات الأسماك الحية.
Abstract
10 – يشكل تقييم مدى توافر المعادن الدقيقة الغذائية تحديا رئيسيا في التغذية المعدنية لأنواع الأسماك. تهدف هذه المقالة إلى وصف نهج منهجي يجمع بين منهجيات مختلفة لتقييم توافر الزنك (Zn) في سلمون المحيط الأطلسي(Salmo salar). وبالنظر إلى أن العديد من الأنواع الكيميائية Zn يمكن أن تكون موجودة في تغذية السلمون الأطلسي، كان من المفترض أن توافر Zn يتأثر الأنواع الكيميائية Zn الموجودة في الأعلاف. وهكذا، في هذه الدراسة، البروتوكول الأول هو حول كيفية استخراج مختلف الأنواع الكيميائية Zn من الأعلاف وتحليلها عن طريق استبعاد حجم الكروماتوغرافيا المقترنة استحثاثيا البلازما الطيفية الشامل (SEC-ICP-MS) الأسلوب. وفي وقت لاحق، تم تطوير طريقة في المختبر لتقييم قابلية الذوبان من Zn الغذائية في أعلاف السلمون الأطلسي. يصف البروتوكول الثالث طريقة دراسة تأثير تغيير تكوين الأنواع الكيميائية Zn على امتصاص Zn في نموذج ظهاري معوي للأسماك باستخدام خط خلايا الأمعاء لتراوت قوس قزح (RTgutGC). معا، تمت مقارنة النتائج من أساليب المختبر مع دراسة في الجسم الحي دراسة توافر واضح من المصادر غير العضوية والعضوية من Zn تكملها إلى أعلاف السلمون الأطلسي. وأظهرت النتائج أنه يمكن العثور على العديد من الأنواع الكيميائية ZN في الأعلاف وكفاءة مصدر Zn العضوية يعتمد كثيرا على ليغاند الأحماض الأمينية المستخدمة لchelate Zn. وكانت نتائج أساليب المختبر أقل ارتباطا بتلك النتيجة من الدراسة في الجسم الحي. ومع ذلك، قدمت بروتوكولات المختبر الموصوفة في هذه المقالة معلومات حاسمة بشأن توافر Zn وتقييمها في أعلاف الأسماك.
Introduction
كانت وجبة السمك وزيت السمك تستخدم تقليديا في تغذية السلمون الأطلسي. ومع ذلك، يتم استبدال هذه المكونات بشكل متزايد من قبل المكونات النباتية1. وقد أدى التحول المذكور أعلاه في تكوين الأعلاف إلى انخفاض توافر الغذاء وزيادة الحاجة إلى تحسين توافر المعادن في أعلاف السلمون الأطلسي، وخاصة الزنك (Zn)2. وقد يكون انخفاض التوافر نتيجة لتغير في مستوى Zn أو الأنواع الكيميائية Zn أو /وعوامل مضادة للتغذية موجودة في مصفوفة الأعلاف. وفي هذا السيناريو، ظهرت مجموعة جديدة من الإضافات التي تعتبر عموما “مصادر عضوية” مع إمكانية أن تكون مصدرا أفضل متاحة للمعادن الغذائية للأسماك. لذلك، من المهم فهم الكيمياء الأساسية وعلم وظائف الأعضاء التي تحكم توافر المعادن ومصادرها للأسماك. الزنك عنصر أساسي تتبع لجميع الكائنات الحية3. وقد وصف دور Zn كجزيء إشارة على كل من مستوى شبه الخلية وداخل الخلايا في الأسماك4. في سمك السلمون الأطلسي, وقد ارتبط نقص ZN مع تشوهات الهيكل العظمي وانخفاض نشاط مختلف المعادن زن5,6.
تصف هذه الدراسة نهجا منهجيا لفهم توافر Zn من خلال تصنيفه إلى أربع مقصورات مختلفة من التعقيد الكيميائي والبيولوجي المتنوع. ويرد وصف الأساليب المعنية في أربعة أقسام، كما يتضح في الشكل 1 : (1)تقييم الأنواع الكيميائية Zn في جزء قابل للذوبان من تغذية السلمون الأطلسي باستخدام حجم استبعاد الكروماتوغرافيا المقترنة استقرائيا البلازما الطيف الكتلي (SEC-ICP-MS) الطريقة7; (2) في الذوبان في المختبر من Zn المكملة في تغذية السلمون الأطلسي؛ (3) تقييم ZN امتصاص الأنواع الكيميائية من قبل في المختبر نموذج الأمعاء (RTgutGC)8; و (4) توافر واضح من ZN في سمك السلمون الأطلسي (Salmo salar)9. ويمكن وضع بروتوكولات مماثلة لمعادن أخرى (مثل المنغنيز والسيلينيوم والنحاس) ذات أهمية غذائية لأنواع الأسماك في تربية الأحياء المائية.
Protocol
Representative Results
Discussion
امتصاص المعوية من زن ويبدو أن تتأثر الشكل الكيميائي للأنواعزن 13. وفي هذا الصدد، أتاح استخدام البروتوكولات الموصوفة في هذه المادة دراسة الجوانب الكيميائية والبيولوجية التي تقوم عليها “توافر” Zn في سلمون المحيط الأطلسي.
وأفادت هذه الدراسة باستخدام طريقة تحليل المواصفات Zn. 10- وقدمت طريقة لجنة الأوراق المالية والبورصة – برنامج المقارنات الدولية – التصلب المتعدد بيانات نوعية تتعلق بالوزن الجزيئي للأنواع الكيميائية من الزن الموجودة في الجزء القابل للذوبان من علف السلمون الأطلسي. وقد تحقق ذلك بالمقارنة مع أوقات الاحتفاظ بمعايير معايرة الوزن الجزيئي (أي الثيروغلوبولين (660 كيلودا) وزن/كو سوبر أكسيد ديسموتاز (32 كيلودا) والميوجلوبين (17 كيلودا) وفيتامين B12 (1.36 كيلودا)) مع أوقات الاحتفاظ ب Zn التي تحتوي على قمم. وكان أحد التحديات التي وجدها تحليل مواصفات Zn هو تحديد الأنواع الكيميائية غير المعروفة من Zn بسبب عدم وجود معايير تحليلية. في لجنة الأوراق المالية والبورصة ، ويستند فصل الجزيئات على أحجامها بالنسبة للمسام في المرحلة الثابتة. من حيث المبدأ ، سوف تنتقل الجزيئات الأكبر بشكل أسرع ، وتنتقل أولا ، وستسافر الجزيئات الأصغر أبطأ ، وتنتقل لاحقاإلى 14. وبالتالي، قد تحتوي كل Zn التي تحتوي على الذروة عدة مركبات ذات وزن جزيئي مماثل15. وهذا يسهم أيضا في التحدي المتمثل في تحديد الأنواع الكيميائية غير المعروفة من نوع Zn. وعلاوة على ذلك، تم اختبار العديد من ظروف استخراج خفيفة لاستخراج ZN. وكان ZN المستخرج منخفضة (~ 10٪). تم تطبيق ظروف استخراج معتدلة للحفاظ على الأنواع الكيميائية ZN سليمة ولكن هذا قد يكون للخطر كفاءة استخراج7.
في اختبار الذوبان في المختبر، الذوبان من Zn المكمل (كما النظير الراديو 65ZnCl2)أشارت إلى أن الأحماض الأمينية، وخاصة الهستيدين والليوزين، وزيادة قابلية الذوبان من ZN (الشكل 5). ويستند استخدام عينات الأعلاف مباشرة لاتقياسات الذوبان في المختبر تحت ظروف الجهاز الهضمي محاكاة على معرفة أن التغيير في الطيف زن هو الأسهق تعتمد16. ومع ذلك، قد تؤدي الظروف الحمضية في بداية الجهاز الهضمي إلى بعض التغيير في التكهنات التي قد تكون لا رجعة فيها (على سبيل المثال، ZnO-> ZnCl2، في وجود HCl في ظل ظروف حمضية في المعدة). ومع ذلك ، فإن مصدر Zn المستخدم هنا هو ZnSO4 وتم تحسين قابلية الذوبان من خلال الأحماض الأمينية في الوسط. وكان السؤال التالي الذي يتعين الإجابة عليه هو، هل يمكن ترجمة زيادة الذوبان إلى توافر؟ تم استخدام خط الخلايا المعوية RTgutGC لدراسة هذا السؤال. في سياق التغذية المعدنية في الحيوانات ، من الصعب تعريف مصطلح “التوافر” ويمكن تنظيمه بشكل تفاضلي في الخلايا (في المختبر) مقارنة بالحيوان (في الجسم الحي). ومن ثم، تم استخدام مصطلح “امتصاص” عندما يتعلق الأمر بتقييم المختبر باستخدام خط الخلايا المعوية. وقدم خط الخلية معلومات مفيدة عن آليات امتصاص Zn في ظهارة الأمعاء التي هي جزء من العملية التنظيمية المعقدة التي تحكم توافر المعادن في الحيوانات. وقد اكتسبت خلايا RTgutGC قدرة أفضل على امتصاص الزنى في وجود حمض أميني (أي الميثيونين؛ الشكل 6). ومع ذلك، فإن التوافر الواضح في الجسم الحي لم يختلف بشكل كبير بين مصادر Zn غير العضوية والعضوية في سمك السلمون الأطلسي. في دراسة توافر في الجسم الحي, تم إجراء مقارنة مصدر Zn في مستويات Zn الغذائية تتجاوز بكثير متطلبات Zn المعروفة من سمك السلمون الأطلسي17, مجموع تركيز ZN من 150 ملغم / كغ تغذية. يتم تصور الاختلافات في التوافر بشكل أفضل عندما تقع المستويات الغذائية التي تم اختبارها في النطاق الديناميكي الخطي قبل أن يصل الحيوان إلى التشبع. في الوقت الحاضر في دراسة الجسم الحي، فمن الممكن أن سمك السلمون الأطلسي كانت مشبعة بشكل جيد إلى الفرق الملحوظ في امتصاص زن بين المصادر المستخدمة.
وباختصار، وفرت الطريقة الأولى معلومات نوعية عن مختلف أنواع الزنا الكيميائية الموجودة في الجزء القابل للذوبان من علف السلمون الأطلسي؛ الطريقة الثانية, في الذوبان في المختبر من ZN تكملة تم تحسين في وجود ligands الأحماض الأمينية; وأكد الأسلوب الثالث أن تحسين الذوبان عن طريق الأحماض الأمينية يمكن أن يحسن امتصاص في ظهارة الأمعاء; وعلى العكس من ذلك، فشلت الطريقة الرابعة في العثور على اختلافات في توافر Zn من المصدر غير العضوي أو العضوي إلى سمك السلمون الأطلسي. وختاما، على الرغم من عدم اتساقها مع النتائج في الجسم الحي، فإن البروتوكولات في المختبر لم توفر رؤى مثيرة للاهتمام في فهم المكونات المختلفة لتوافر Zn.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تنفيذ هذا العمل في إطار مشروع APREMIA (توافر المعادن ومتطلباتها في سلمون المحيط الأطلسي، المنحة رقم 244490) الممولة من قبل مجلس البحوث النرويجي.
Materials
| 0.45 µm syringe filter | Sartorius | ||
| 0.45 μm membrane filter | Pall | ||
| 10 % fetal bovine serum | Eurobio | ||
| 1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter | LKB Wallac | ||
| 24 well plates (Falcon, TPP microplates) | Thermo Fisher Scientific | 10048760 | |
| 2-aminobicyclo(2.2.1)heptane-2-carboxylic acid | Sigma Aldrich | A7902 | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks) | TPP Techno Plastic Products AG | 90075 | |
| L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
| Bradford assay kit | Bio-Rad | 5000001 | |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5702 | ||
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | 30089 | |
| DL-methionine | Alfa Aesar | 59-51-8 | |
| D-methionine | Sigma Aldrich | M9375 | |
| Experimental fish feeds | Skretting | ||
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Guard column, TSKgel SWxl Type (7 μm particle size) | Tosoh | ||
| L-Histidine | Sigma Aldrich | 53319 | |
| HPLC coupled with a 7500ce ICP-MS | Agilent Technologies | ||
| Hydrochloric acid | Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck | 1.00317 | |
| Knife mill | GM 300, Retsch Gmbh | ||
| L-15 medium | Invitrogen/Gibco | 21083027 | |
| L-methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
| L-Lysine | Sigma Aldrich | 23128 | |
| Methanol | LiChrosolv, HPLC grade, Merck | 1.06035 | |
| Milli-Q water (18.2 MΩ cm) | EMD Millipore Corporation | ||
| Myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
| NexION 350D ICP-MS | Perkin Elmer | ||
| Pasteur pipette | VWR | ||
| pH meter | inoLab | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | 806552 | |
| RTgutGC cells | Obtained in kind from Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Switzerland | ||
| SEC column, TSKgel G3000SWxl | Tosoh | ||
| Sieve stainless steel (850 μm – 1.12 mm) | Retsch | ||
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | 436143 | |
| Superoxide dismutase | Sigma Aldrich | S7571 | |
| Thyroglobulin | Sigma Aldrich | T1001 | |
| Tricaine methanesulphonate | PharmaQ | ||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypsin in 0.25% in phosphate-buffer saline | Biowest | L0910 | |
| Versene EDTA solution | Invitrogen/Gibco | 15040-033 | |
| Vitamin B12 | Sigma Aldrich | V2876 | |
| Zinc chelate of glycine | Phytobiotics | ||
| Zinc sulphate | Vilomix |
References
- Ytrestoyl, T., Aas, T. S., Asgard, T. Utilisation of feed resources in production of Atlantic salmon (Salmo salar) in Norway. Aquaculture. 448, 365-374 (2015).
- Prabhu, P. A. J., et al. Evaluating dietary supply of microminerals as a premix in a complete plant ingredient-based diet to juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture Nutrition. 24 (1), 539-547 (2018).
- Maret, W. Zinc biochemistry: from a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
- Hogstrand, C., Wood, C. M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. . Fish Physiology. 31, 135-200 (2011).
- Baeverfjord, G., et al. Mineral nutrition and bone health in salmonids. Reviews in Aquaculture. , (2018).
- Maage, A., Julshamn, K. Assessment of zinc status in juvenile Atlantic salmon (Salmo salar) by measurement of whole body and tissue levels of zinc. Aquaculture. 117 (1), 179-191 (1993).
- Silva, M. S., Sele, V., Sloth, J. J., Araujo, P., Amlund, H. Speciation of zinc in fish feed by size exclusion chromatography coupled to inductively coupled plasma mass spectrometry – Using fractional factorial design for method optimization and mild extraction conditions. Journal of Chromatography B. , (2018).
- Prabhu, A. J., et al. Zinc uptake in fish intestinal epithelial model RTgutGC: Impact of media ion composition and methionine chelation. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 50, 377-383 (2018).
- Silva, M. S., et al. Apparent availability of zinc, selenium and manganese as inorganic metal salts or organic forms in plant-based diets for Atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture. 503, 562-570 (2019).
- Persson, D. P., Hansen, T. H., Laursen, K. H., Schjoerring, J. K., Husted, S. Simultaneous iron, zinc, sulfur and phosphorus speciation analysis of barley grain tissues using SEC-ICP-MS and IP-ICP-MS. Metallomics. 1 (5), 418-426 (2009).
- Lothian, A., Roberts, B. R. Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Minghetti, M., Schirmer, K. Effect of media composition on bioavailability and toxicity of silver and silver nanoparticles in fish intestinal cells (RTgutGC). Nanotoxicology. 10 (10), 1526-1534 (2016).
- Glover, C. N., Hogstrand, C. Amino acid modulation of in vivo intestinal zinc absorption in freshwater rainbow trout. Journal of Experimental Biology. 205 (1), 151-158 (2002).
- Ekman, R., Ekman, R. . Mass spectrometry: Instrumentation, interpretation, and applications. Wiley Series on Mass Spectrometry. , 105-115 (2009).
- Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. A Review Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and Their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 35 (20), 2923-2950 (2012).
- Krezel, A., Maret, W. The biological inorganic chemistry of zinc ions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 611, 3-19 (2016).
- National Research Council. . Nutrient Requirements of Fish and Shrimp. , (2011).
