Avaliação da disponibilidade mineral em rações de peixe usando métodos complementares demonstrados com o exemplo de zinco no salmão atlântico

O ensaio alimentar na seção 4 foi realizado de acordo com a legislação norueguesa (FOR-2015-06 – 18-761) e europeia (Diretiva 2010/63/UE). 1. Avaliação de espécies químicas ZN na fração solúvel de uma ração de salmão do Atlântico usando um método SEC-ICP-MS Tampão de extração (100 mM Tris-HCl, pH 8.5) Prepare o tampão de extração dissolvendo uma quantidade apropriada de tris (hidroximetila)aminometano para atingir a força iônica desejada (100 mM) em ultrapure H2O. Ajuste o pH da solução para pH 8.5 com solução HCl, monitorando a troca de pH com um medidor de pH. Preparação de amostras de raçãoNOTA: A amostra de ração utilizada foi formulada com base em ração comercial para salmão atlântico, contendo fontes proteicas principalmente de ingredientes à base de plantas (ou seja, aproximadamente 5% de proteína de peixe, 10% óleo de peixe, 68% proteína à base de plantas e 12% óleo à base de plantas). Sulfato de zinco foi complementado à alimentação. Triture a amostra de ração à mão usando um pilão e uma argamassa. Peneirar a amostra de ração para garantir que a extração seja realizada em uma fração de alimentação com tamanho de partícula semelhante (de 850 μm a 1,12 mm). Prossiga para realizar a extração de Zn. Extração de zinco de uma amostra de ração Pesar aproximadamente 0,5 g de ração em triplicado em tubos cônicos de 15 mL. Adicione o tampão de extração (5 mL de 100 mM Tris-HCl, pH 8.5) às amostras. Extrair as amostras em um rotador (20 rpm) a 4 °C por 24 h. Separe as frações solúveis e não solúveis por centrifugação por 10 min a 3000 x g. Use um filtro de seringa descartável de 0,45 μm para filtrar a fração solúvel. Transfira as amostras filtradas para tubos limpos. Realize a análise de especiação de Zn nas frações solúveis utilizando SEC-ICP-MS, conforme descrito na etapa 1.6.NOTA: Um resumo do procedimento para extração de Zn de uma amostra de ração é descrito na Figura 2. Solução de fase móvel (50 mM Tris-HCl + 3% MeOH, pH 7.5) Prepare a solução de fase móvel dissolvendo 6,057 g de tris (hidroximetila)aminometano em 1 L de solução meOH de 3% (v/v). Ajuste o pH da solução para pH para 7,5 com solução HCl, monitorando a troca de pH com um medidor de pH. Filtre a solução de fase móvel através de um filtro de membrana de 0,45 μm. Calibração de peso molecular da faixa de separação da coluna SEC Calibrar o intervalo de separação realizando uma calibração de peso molecular.NOTA: Neste estudo foram utilizadas a tireoglobulina (660 kDa), a dismutase de superóxido Zn/Cu (32 kDa), a mioglobina (17 kDa) e a vitamina B12 (1,36 kDa). Prepare cada um dos padrões com uma concentração conhecida em ultrapure H2O. Prepare um frasco de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) adicionando 250 μL de padrão a um frasco. Carregue os frascos com padrões para a sequência das amostras. Execute a calibração do peso molecular no início e no final da sequência analítica, monitorando 127I (tiroglobulina), 66Zn (zn/cu superóxido dismutase), 57Fe (mioglobina) e 59Co (vitamina B12).NOTA: A calibração do peso molecular é realizada simultaneamente com a análise de especiação de Zn. Análise de especiação de zinco usando SEC-ICP-MSNOTA: A análise de especiação de Zn pelo método SEC-ICP-MS foi desenvolvida com base em princípios descritos em outros lugares10,11 e outra otimização foi realizada para a análise de uma ração de salmão atlântico7. Realize a análise de especiação de Zn nas frações solúveis usando uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e um HPLC juntamente com espectroscopia de massa plasmática indutivamente acoplada (ICP-MS). Prepare um frasco HPLC adicionando 250 μL de fração solúvel a um frasco. Antes da análise, aumente todas as amostras com 0,5 μL de vitamina B12. Esta etapa permite corrigir para mudanças de tempos de retenção, monitorando 59Co. Diluir a fração solúvel com tampão de extração (100 mM Tris-HCl, pH 8.5) e ajustar-se a um volume final de 1 mL. Prepare a sequência das amostras em ordem aleatória. Sintonize o ICP-MS de acordo com as instruções do fabricante. Siga as configurações do instrumento para o HPLC e ICP-MS executando a análise de especiação de Zn (ver Tabela 1). 2. Solubilidade in vitro de Zn suplementada na ração de salmão do Atlântico NOTA: A amostra de ração utilizada foi formulada com base em ração comercial para salmão atlântico, contendo fontes proteicas principalmente de ingredientes à base de plantas (ou seja, aproximadamente 5% de farinha de peixe, 10% óleo de peixe, 68% ingredientes à base de plantas e 12% óleo vegetal). Triture as amostras de ração de salmão do Atlântico por 10 s a 3000 rpm usando uma usina de facas e armazene a 4 °C até uma análise mais aprofundada. Pese ~0,2 g das amostras de ração moídas na etapa 2.1 e adicione o radiotracer Zn(65Zn) de atividade específica conhecida em um tubo de amostra de volume de 5 mL (com uma tampa).ATENÇÃO: Este procedimento deve ser realizado dentro de uma suíte de radionuclídeo. A pessoa que realiza esta etapa deve ser treinada e certificada para lidar com isótopos de rádio. As medidas de segurança e precaução aconselhadas pela administração de segurança de radiação do instituto devem ser rigorosamente seguidas. Em seguida, prepare a solução de tampão luminal intestinal de água doce, conforme descrito abaixo. Para solução de sal A, pese 11,65 g de NaNO3, 0,55 g de KNO3 e 0,4 g de MgSO4. Dissolva os sais em ultrapura H2O e ajuste a um volume final de 60 mL. Para solução de sal B, pese 0,31 g de Ca(NO3)2· 4 H2O. Dissolva os sais em ultrapura H2O e ajuste a um volume final de 10 mL. Use a solução de estoque HEPES de 500 mM como solução de sal C. Para solução de sal D, pese 1,2 g de MgCl2,dissolva o sal em ultrapure H2O e ajuste a um volume final de 20 mL. Para solução de sal E, pesar 0,9 g de MgSO4,dissolver o sal em ultrapure H2O e ajustar a um volume final de 20 mL. Prepare a solução de piruvato dissolvendo 0,55 g de CH3COCOONa em 10 mL de ultrapure H2O. Dissolver 0,9 g de galactose (C6H12O6) em ultrapure H2O. Dissolver bem usando um agitador magnético e esterilizar soluções de sal A, B, D e E por autoclavagem, e solução C, piruvato e galactose por filtragem através de um filtro de seringa de 200 μm. Após a elaboração das diferentes soluções de estoque, para preparar 100 mL de solução de trabalho do buffer, misture as soluções acima preparadas na seguinte proporção: 6,8 mL de solução de sal A, 4,14 mL de B, 5 mL de C, 2,5 mL de D, 1,5 mL de E e 1,14 mL cada de pirutil e galactose. Coma o volume até 100 mL usando água deionizada.NOTA: O tampão acima representará agora a composição iônica do lúmen intestinal encontrado em salmonides de água doce. Prepare seis outras alíquotas do tampão descritas na etapa 2.6 e adicione um dos seguintes aminoácidos (cisteína, metomínea, glicina, histidina, lisina e arginina) para alcançar uma concentração molar final de 5 mM. Adicione o tampão luminal intestinal de água doce (volume de reação = 3 mL; pH 7,4) à amostra de alimentação. Repita o passo 2.5 com os buffers descritos em 2.4 (na presença de diferentes aminoácidos na concentração de 5 mM). Feche os tubos e deixe-os girar em um rotador rotativo por 30 min a 25 rpm. Separe as frações solúveis e não solúveis por centrifugação por 10 min a 1157 x g. Use um caixa gama para medir as contagens por minuto (cpm) de 65Zn nas frações solúveis e não solúveis. Calcule a proporção dos isótopos de rádio de Zn (65Zn) presentes nas frações solúveis e não solúveis. 3. Avaliação da absorção de espécies químicas Zn utilizando um modelo intestinal in vitro (RTgutGC) Cultura de células RTgutGCNOTA: Todos os materiais de trabalho utilizados nesta etapa devem ser estéreis. Reviva as células RTgutGC congeladas suavemente em um banho de água a 20 °C. Pipeta suavemente a solução contendo as células e suspenda-as em 10 mL de meio L15 contendo 10% de soro bovino fetal (FBS).NOTA: 10% FBS é usado apenas para reviver as células congeladas. Para passagem subsequente, o FBS é usado em 5%. A composição da FBS pode variar entre os lotes, por isso é aconselhável comprar e estocar o quanto for necessário de um único lote para evitar variações entre lotes na composição do soro. Adicione a suspensão celular a frascos de cultura celularde 75 cm e incubar em uma incubadora a 19 °C sob atmosfera normal. Verifique as células e quando confluente (80% de confluência, avalie visualmente examinando a densidade da superfície celular sob um microscópio), divida as células em novos frascos (passagem subsequente) ou colheita para uso em experimentos.NOTA: Um exemplo das células RTgutGC 1h e 1 semana após a semeadura para os frascos de cultura celular é mostrado na Figura 3. Colheita celular e preparação para experimentos de exposição Lave as células duas vezes com 1 solução de ácido edradiaminatraacético de 1 mL (EDTA). Após cada lavagem, sifão a solução EDTA usando um tubo de sucção estéril. Trate as células com trippsina (0,7 mL de trippsina, em 0,25% em soro fisiológico tamponado por fosfato [PBS]). Gire suavemente o frasco em ângulos agudos para espalhar a trippsina ao longo da superfície do frasco. Continue a rotação por 2 minutos, enquanto as células se desprendem. Depois de girar suavemente por 2 min, adicione 10 mL de meio L15/FBS para neutralizar a trippsina. Decante a suspensão celular resultante em um tubo cônico de centrífuga inferior usando uma pipeta estéril e centrífuga por 3 min a 130 x g. Determine a densidade das células colhidas por contagem manual usando hemótmetro. Adicione o volume necessário de meio L15/FBS para atingir uma densidade celular de 5 x 104 células/mL. Semear as células em placas de 24 poços, pipetando 1 mL de suspensão celular por poço para atingir a densidade celular final de 5 x 104 células/poço.NOTA: Use preferencialmente pipetas de vários distribuidores para minimizar a variação e reduzir o tempo. Coloque as placas semeadas em uma incubadora em atmosfera normal a 19 °C por 48 h antes dos experimentos.NOTA: Trippsina a ser armazenada a -20 °C; Solução EDTA e mídia L15/FBS a 4 °C. Ajuste a temperatura de todas as soluções de trabalho e mídia para 19 °C pouco antes de usar. Preparação de mídia de exposição NOTA: Este passo deve ser feito sob o capô da fumaça sob condições assépticas e estéreis. Prepare L15/ex misturando 6,8 mL de solução de sal A (etapa 2.3.1), 1,14 mL de B (etapa 2.3.2), 5 m L de C (etapa 2.3.3), e 1,14 mL cada de piruvato (etapa 2.3.6) e galactose (etapa 2.3.7). Coma o volume até 100 mL usando água destilada de grau de cultura celular estéril. Prepare FW misturando 6,8 mL de solução de sal A (2.3.1), 4,14 mL de B (2.3.2), 5 mL de C (2.3.3), 2,5 mL de D (2.3.4), 1,5 mL de E (2,3,5) e 1,14 mL cada um de piruvato (2.3.6) e galactose (2.3.7). Coma o volume até 100 mL usando água destilada estéril e de grau de cultura celular. Quantifique as concentrações de íons nos meios de exposição usando ICP-MS como descrito em outros lugares12.NOTA: As concentrações iônicas analisadas nos preparativos da mídia são apresentadas na Tabela 2. Ensaios de influxo de zinco(65Zn) Semente as células RTgutGC em placas de 24 poços (5 x 104 células/bem) em meio L15/FBS completo. Incubar por 48 h em uma incubadora com atmosfera normal a 19 °C. Ajuste todas as preparações experimentais de mídia para pH 7.4 usando 0,5 M NaOH na presença ou ausência de L-methionina (L-Met) ou DL-methionine (DL-Met) na concentração de 2 mM.NOTA: O ajuste de pH dos buffers descritos em 3.4.3 precisa ser feito recentemente antes do tratamento das células na etapa 3.4.5. Após a conclusão do período de incubação, retire o meio dos poços e enxágue bem com PBS. Adicione a mídia experimental FW ajustada por pH e deixe aclimatar por 20 minutos. Exponha as células RTgutGC a concentrações nominais de 3,07, 6,14, 12,27 e 24,55 μM 65Zn(II) (como ZnCl2; ~4 kBq/mL) na mídia descrita na etapa 3.4.3. Imediatamente depois, mantenha as células na incubadora a 19 °C por 15 min. Após o fim da incubação de 15 minutos, aspire a cultura supernante e retire do poço. Enxágüe as células com meio FW frio gelado (com 200 μM Zn, pH 7.4) e, em seguida, sacie a saciar adicionando o tampão de 5 mM de etileno glicol-bis (β-aminoetil ether)-N,N’,N’,N’-tetraactic acid (EGTA) tampão (pH 7.4) por 5 minutos, para se livrar de qualquer adsorte 65Zn(II). Exponha as células às preparações de mídia acima na presença ou ausência de 10 mM 2-Aminobicyclo [2.2.1] ácido heptano-2-carboxílico (BCH), um inibidor de transporte de aminoácidos. Após o período de exposição de 15 min, repetimos as etapas 3.4.8 e 3.4.9. As células RtgutGC serão aderidas à parte inferior dos poços como uma monocamada. Digerir as células usando detergente de sulfato de dodecyl de sódio quente (SDS) de 0,2% quente (SDS) detergente (100 μL/well).NOTA: A solução SDS precisa ser colocada por 1h em um banho de água definido a 90 °C antes de ser usado. Aspire e recupere a digestão celular em um tubo de 1,5 mL. Meça a radioatividade dos digestores celulares usando um contador gama.NOTA: As contagens por minuto (cpm) precisam ser corrigidas para decomposição radioativa, atividade de fundo e são submetidas a cálculos de atividades específicas seguindo as fórmulas descritas por Glover e Hogstrand13. Para quantificar a concentração proteica das células, homogeneize as células com 500 μL de 0,5 M NaOH. Use um kit de ensaio de Bradford para medir a concentração de proteína na amostra celular, com albumina de soro bovino (BSA) como padrão.NOTA: Uma vez quantificada a concentração de proteína, a taxa de absorção de Zn por células RTgutGC pode ser expressa como pmoles Zn min-1 mg-1 proteína. 4. Aparente disponibilidade de Zn dietético em salmão atlântico(Salmo salar) NOTA: As rações de salmão do Atlântico foram formuladas com base em rações comerciais, contendo fontes proteicas principalmente de ingredientes à base de plantas (ou seja, aproximadamente 5% de proteína de peixe, 10% óleo de peixe, 68% proteína à base de plantas e 12% óleo vegetal). Dois alimentos foram suplementados com uma fonte inorgânica (sulfato Zn) ou uma fonte orgânica (Zn chelate de glicina) para alcançar uma concentração de Zn de 150 mg/kg de ração. Além disso, o óxido de Ítrio (grau de alimentação) foi adicionado à alimentação em 0,01% como marcador inerte para permitir o cálculo do coeficiente de disponibilidade aparente. Aclimatize o salmão atlântico (cepa SalmoBreed, 1+ anos, grupos de sexo misto) em seus respectivos tanques até que os peixes estejam acostumados às condições experimentais. Avalie a aclimatação do salmão do Atlântico monitorando sua ingestão diária de ração.NOTA: Este ensaio foi realizado em tanques triplicados, assim foram utilizados um total de seis tanques. Durante o ensaio de alimentação, a temperatura da água foi de 11,9 ± 0,3 °C e a saturação de oxigênio dissolvida foi de 101 ± 5%. Alimente o peixe com rações experimentais por 11 dias. Eutanize o peixe por overdose usando 6 mL de solução de estoque de metanossulfonato tricaine por litro de água. Colete uma amostra agrupada de fezes do peixe do mesmo tanque em uma placa, retirando da barbatana ventral ao ânus. Remova as fezes da placa com uma espátula em um tubo cônico de 50 mL e armazene imediatamente as amostras a -20 °C.NOTA: As amostras foram mantidas a -20 °C até uma análise posterior. Congele as amostras de fezes por 72 h a -80 °C. Homogeneize manualmente a amostra de fezes em pó fino usando um pilão e argamassa. Determine a concentração de Zn e Ítrio nas amostras de ração e fezes utilizando um ICP-MS (conforme descrito em outros lugares9). Determine o coeficiente de disponibilidade aparente (AAC, %) utilizando a seguinte fórmula: