Atlantik Somonunda Çinko Örneğiyle Gösterilen Tamamlayıcı Yöntemler Kullanılarak Balık Yemlerinde Mineral Kullanılabilirliğinin Değerlendirilmesi

Bölüm 4’teki besleme denemesi Norveççe (FOR-2015-06 – 18-761) ve Avrupa mevzuatına (Direktif 2010/63/AB) göre gerçek gerçekleştirildi. 1. Sec-ICP-MS yöntemi kullanılarak Atlantik somon yeminin çözünür fraksiyonunda Zn kimyasal türlerinin değerlendirilmesi Ekstraksiyon tamponu (100 mM Tris-HCl, pH 8.5) Ultra saf H2O’da istenen iyonik mukavemete (100 mM) ulaşmak için uygun miktarda tris (hidroksimetil)aminometan eriterek ekstraksiyon tamponu hazırlayın. Çözeltinin pH’ını HCl çözümü ile pH 8.5’e ayarlayın ve pH değişimini bir pH ölçerle takip edin. Yem örneklerinin hazırlanmasıNOT: Kullanılan yem örneği, esas olarak bitki bazlı bileşenlerden (%5’e kadar balık proteini, balık yağı, bitki bazlı protein ve bitki bazlı yağ) protein kaynakları içeren Atlantik somonu için ticari yemlere dayalı olarak formüle edilmiştir. Çinko sülfat yem için desteklendi. Yem örneğini bir pestle ve harç kullanarak elle öğütün. Ekstraksiyonun benzer parçacık boyutuna (850 μm ila 1,12 mm) sahip bir besleme fraksiyonunda gerçekleştirilmesini sağlamak için besleme örneğini elekleyin. Zn çıkarma işlemini gerçekleştirmeye devam edin. Yem örneğinden çinko ekstraksiyonu 15 mL konik borulara üç taraflı olarak yaklaşık 0,5 g yem ağırlığındadır. Ekstraksiyon tamponu (5 mL 100 mM Tris-HCl, pH 8.5) numunelere ekleyin. Numuneleri 24 saat boyunca 4 °C’de bir rotatorda (20 rpm) çıkarın. Çözünür ve çözünmeyen fraksiyonları 3000 x g’da10 dakika santrifüjleme ile ayırın. Çözünür fraksiyonu filtrelemek için 0,45 μm tek kullanımlık şırınna filtresi kullanın. Filtrelenmiş numuneleri temiz tüplere aktarın. 1.6. adımda açıklandığı gibi SEC-ICP-MS kullanarak çözünür kesirlerde Zn belirtim çözümlemesi gerçekleştirin.NOT: Bir besleme örneğinden Zn ekstraksiyonu prosedürünün bir özeti Şekil 2’de açıklanmıştır. Mobil faz çözümü (50 mM Tris-HCl + %3 MeOH, pH 7,5) 6.057 g tris (hidroksimetil)aminometan çözünen mobil faz çözeltisini %3 MeOH çözeltisinin (v/v) 1 L’sinde hazırlayın. PH değişimini bir pH ölçerle izleyerek, çözümün pH’ını HCl çözümüyle pH’a 7,5’e ayarlayın. Mobil faz sokumunu 0,45 μm membran filtresinden geçirin. SEC sütun ayırma aralığının moleküler ağırlık kalibrasyonu Moleküler ağırlık kalibrasyonu yaparak ayırma aralığını kalibre edin.NOT: Bu çalışmada tiroglobulin (660 kDa), Zn/Cu süperoksit dismutaz (32 kDa), miyoglobin (17 kDa) ve B12 vitamini (1.36 kDa) kullanılmıştır. Standartların her birini ultra saf H2O’da bilinen bir konsantrasyonla hazırlayın. Bir şişeye 250 μL standart ekleyerek yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi (HPLC) şişesi hazırlayın. Şişeleri örneklerin sıralı çalışmasına standartlarla yükleyin. Moleküler ağırlık kalibrasyonunu analitik dizinin başında ve sonunda çalıştırın, 127I (tiroglobulin), 66 Zn(Zn/Cu süperoksit dismutaz), 57Fe (miyoglobin) ve 59Co (B12 vitamini) izlenmesini izler.NOT: Moleküler ağırlık kalibrasyonu, Zn speciation analizi ile aynı anda gerçekleştirilir. SEC-ICP-MS kullanılarak çinko spektrasyon analiziNOT: SEC-ICP-MS yöntemi ile Zn spesifikasyonanalizi,10 , 11’inbaşka bir yerinde açıklanan ilkelere dayanarak geliştirilmişve Atlantik somon yemi7analizi için daha fazla optimizasyon gerçeklenmiştir. Bir boyut dışlama kromatografisi (SEC) sütunu ve endüktif olarak birleştirilmiş plazma kütle spektroskopisi (ICP-MS) ile birleştirilmiş bir HPLC kullanarak çözünür fraksiyonlar üzerinde Zn spesifikasyon analizini gerçekleştirin. Bir şişeye 250 μL çözünür fraksiyon ekleyerek bir HPLC şişesi hazırlayın. Analizden önce, tüm örnekleri 0,5 μL B12 vitamini ile çivilenin. Bu adım, saklama süreleri vardiyalarını düzeltmeye ve 59Co’nun izlenmesine olanak tanır. Çözünür fraksiyonu ekstraksiyon tamponu (100 mM Tris-HCl, pH 8.5) ile seyreltin ve 1 mL’lik son hacme ayarlayın. Örneklerin sıra çalışmasını rasgele sırayla hazırlayın. ICP-MS’i üreticinin yönergelerine göre ayarlayın. Zn speciation analizini gerçekleştiren HPLC ve ICP-MS için cihaz ayarlarını izleyin (bkz. Tablo 1). 2. Atlantik somon yemlerinde takviyeli Zn’nin in vitro çözünürlüğü NOT: Kullanılan yem örneği, esas olarak bitki bazlı bileşenlerden (%5’e kadar balık unu, balık yağı, bitki bazlı içerik ve bitkisel yağ) protein kaynakları içeren Atlantik somonu için ticari yemlere dayanarak formüle edilmiştir. Atlantik somon yem örneklerini bir bıçak değirmeni kullanarak 3000 rpm’de 10 sn öğütün ve bir sonraki analize kadar 4 °C’de saklayın. Adım 2.1’de besleme numunelerinin ~0,2 g’ını tartın ve 5 mL hacimli bir numune tüpüne (kapaklı) bilinen belirli aktivitenin Zn radyotracer’ını(65Zn) ekleyin.DİkKAT: Bu prosedür bir radyonüklid paketi içinde yapılmalıdır. Bu adımı gerçekleştiren kişi radyo izotoplarını işlemek için eğitilmeli ve sertifikalandırılmalıdır. Enstitünün radyasyon güvenliği idaresi tarafından tavsiye edilen güvenlik ve ihtiyati tedbirlere kesinlikle uyulmalıdır. Daha sonra aşağıda açıklandığı gibi tatlı su bağırsak ışık tampon çözeltisini hazırlayın. Tuz çözeltisi A için, 11,65 g NaNO3,0,55 g KNO3 ve 0,4 g MgSO4ağırlığındadır. Tuzları ultra saf H2O’da çözün ve 60 mL’lik son hacme ayarlayın. Tuz çözeltisi B için 0,31 g Ca(NO3)2· 4 H2O. Tuzları ultra saf H2O’da çözün ve 10 mL’lik son hacme ayarlayın. Tuz çözeltisi C olarak 500 mM HEPES stok çözeltisi kullanın. Tuz çözeltisi D için, 1,2 g MgCl2ağırlığında, tuzu ultra saf H2O’da çözün ve 20 mL’lik son hacme ayarlayın. Tuz çözeltisi E için, 0,9 g MgSO4ağırlığında, tuzu ultra saf H2O’da çözün ve 20 mL’lik son hacme ayarlayın. 0,55 g CH3COCOONa’yı 10 mL ultra saf H2O’da çözerek piruvat çözeltisi hazırlayın. Ultra saf H 2 O’da0,9g galaktozu (C 6 H12O6)çözün. Manyetik bir karıştırıcı kullanarak iyice çözün ve A, B, D ve E tuz çözeltilerini otomatik olarak kaplayarak sterilize edin ve C, piruvat ve galaktozu 200 μm şırınga filtresinden filtrasyonla çözün. Farklı stok çözeltilerinin hazırlanmasından sonra, tamponun 100 mL çalışma çözeltisini hazırlamak için, yukarıdaki hazırlanmış çözeltileri aşağıdaki oranda karıştırın: 6,8 mL tuz çözeltisi A, 4,14 mL B, 5 mL C, 2,5 mL D, 1,5 mL E ve 1,14 mL piruvat ve galakto. Deiyonize su kullanarak hacmi 100 mL’ye kadar yapın.NOT: Yukarıdaki tampon artık tatlı su salmonidlerinde bulunan bağırsak lümeninin iyonik bileşimini temsil edecektir. Adım 2.6’da açıklanan tamponun diğer altı aliquotunu hazırlayın ve 5 mM’lik son azı dişi konsantrasyonuna ulaşmak için aşağıdaki amino asitlerden birini (sistein, metisin, glisin, histidin, lizin ve arginin) ekleyin. Tatlı su bağırsak ışık tamponu (reaksiyon hacmi = 3 mL; pH 7.4) besleme örneğine ekleyin. 2.4’te açıklanan tamponlarla (5 mM konsantrasyonda farklı amino asitlerin varlığında) 2.5 adımını tekrarlayın. Tüpleri kapatın ve 25 rpm’de 30 dakika boyunca döner bir spinner içinde dönmelerine izin verin. Çözünür ve çözünmeyen fraksiyonları 1157 x g’da10 dakika santrifüjleme ile ayırın. Çözünür ve çözünmeyen kesirlerde dakika başına 65 Znsayısını (cpm) ölçmek için gama veznedar kullanın. Çözünür ve çözünmeyen fraksiyonlarda bulunanZn (65Zn) radyo izotoplarının oranını hesaplayın. 3. Zn kimyasal türlerinin in vitro intestinal modeli (RTgutGC) kullanılarak alınması değerlendirmesi RTgutGC hücreleri kültürüNOT: Bu adımda kullanılan tüm çalışma malzemeleri steril olmalıdır. Donmuş RTgutGC hücrelerini 20 °C’de ayarlanmış bir su banyosunda hafifçe canlandırın. Hücreleri içeren çözeltiyi hafifçe pipetle atın ve % 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren 10 mL L15 ortamında askıya alın.NOT: FBS sadece donmuş hücreleri canlandırmak için kullanılır. Sonraki geçiş için FBS% 5 oranında kullanılır. FBS bileşimi partiler arasında değişebilir, bu nedenle serum bileşimindeki partiler arası varyasyonları önlemek için tek bir partiden gerektiği kadar satın almanız ve stoklamak tavsiye edilir. Hücre süspansiyonu 75 cm2 hücre kültürü şişesine ekleyin ve normal atmosfer altında 19 °C’de ayarlanmış bir inkübatörde kuluçkaya yatırın. Hücreleri kontrol edin ve birleştiğinde ( izdiham, mikroskop altında hücre yüzeyinin yoğunluğunu inceleyerek görsel olarak değerlendirin), hücreleri yeni şişelere bölün (sonraki geçiş) veya deneylerde kullanmak için hasat yapın.NOT: Hücre kültürü şişelerine tohumlamadan 1 saat 1 hafta sonra RTgutGC hücrelerinin bir örneği Şekil 3’tegösterilmiştir. Hücre hasadı ve maruz kalma deneylerine hazırlık Hücreleri 1 mL etileniaminetetraasetik asit (EDTA) çözeltisi ile iki kez yıkayın. Her yıkamadan sonra, steril bir emme tüpü kullanarak EDTA çözeltisini sifonleyin. Hücreleri tripsin ile tedavi edin (0.7 mL tripsin, fosfat tamponlu salinde % 0.25’te [PBS]). Tripini şişenin yüzeyine yaymak için şişeyi akut açılarda hafifçe döndürün. Hücreler ayrılırken 2 dakika boyunca döndürmeye devam edin. 2 dakika hafifçe döndükten sonra, tripsin nötralize etmek için 10 mL L15 / FBS orta ekleyin. Elde eden hücre süspansiyonu, steril bir pipet ve santrifüj kullanarak 130 x g’da 3 dakika boyunca konik bir alt santrifüj tüpüne deklare edin. Hemositometre kullanarak manuel sayarak hasat edilen hücrelerin yoğunluğunu belirleyin. 5 x 104 hücre/mL hücre yoğunluğu elde etmek için gerekli L15/FBS ortamı hacmini ekleyin. 5 x 10 4 hücre/kuyunun son hücre yoğunluğuna elde etmek için kuyu başına 1 mL hücre süspansiyonu pipetleme ile hücreleri24 kuyu plakalarına tohumlayın.NOT: Varyasyonu en aza indirmek ve zamanı azaltmak için tercihen çok dağıtımlı pipetler kullanın. Tohumlu plakaları deneylerden önce 48 saat boyunca 19 °C’de normal atmosfer altında bir inkübatöre yerleştirin.NOT: -20 °C’de saklanacak tripsin; 4 °C’de EDTA çözümü ve L15/FBS ortamı. Kullanımdan hemen önce tüm çalışma çözümlerinin ve ortamların sıcaklığını 19 °C’ye ayarlayın. Pozlama ortamlarının hazırlanması NOT: Bu adım duman kaputunun altında aseptik ve steril koşullarda yapılmalıdır. 6,8 mL tuz çözeltisi A (adım 2,3,1), 1,14 mL B (adım 2,3,2), 5 mL karıştırarak L15/ex hazırlayın C (adım 2.3.3) ve 1.14 mL her biri piruvat (adım 2.3.6) ve galaktoz (adım 2.3.7). Steril hücre kültürü sınıfı damıtılmış su kullanarak hacmi 100 mL’ye kadar yapın. 6,8 mL tuz çözeltisi A (2,3,1), 4,14 mL B (2,3,2), 5 mL C (2,3,3), 2,5 mL karıştırarak FW hazırlayın D (2.3.4), 1.5 mL E (2.3.5) ve 1.14 mL her biri pirvavat (2.3.6) ve galaktoz (2.3.7). Steril, hücre kültürü sınıfı damıtılmış su kullanarak hacmi 100 mL’ye kadar yapın. Başka bir yerde açıklandığı gibi ICP-MS kullanarak pozlama medyasındaki iyon konsantrasyonlarını ölçün12.NOT: Medya preparatlarında analiz edilen iyonik konsantrasyonlar Tablo 2’desunulmuştur. Çinko(65Zn) akın tahlilleri RTgutGC hücrelerini tam L15/FBS ortamında 24 kuyu plakasına (5 x10 4 hücre/kuyu) tohumlayın. 19 °C’de normal atmosfere sahip bir inkübatörde 48 saat kuluçkaya yatırın. L-methionine (L-Met) veya DL-methionine (DL-Met) 2 mM konsantrasyonda varlığında veya yokluğunda 0,5 M NaOH kullanarak tüm deneysel medya preparatlarını pH 7.4’e ayarlayın.NOT: 3.4.3’te açıklanan tamponların pH ayarının, 3.4.5. Kuluçka süresinin tamamlanmasından sonra, ortamı kuyulardan çıkarın ve PBS ile iyice durulayın. pH ayarlı FW deneysel medyayı ekleyin ve 20 dakika boyunca iklimlendirmeye izin verin. RTgutGC hücrelerini, 3.4.3 adımında açıklanan ortamda 3.07, 6.14, 12.27 ve 24.55μM 65 Zn(II)(ZnCl 2; ~4 kBq/mL olarak) nominal konsantrasyonlarına maruz maruzleyin. Hemen ardından, inkübatördeki hücreleri 19 °C’de 15 dakika tutun. 15 dakikalık inkübasyon bittikten sonra, kültürün üst kültürünü epire edin ve kuyudan çıkarın. Hücreleri buz gibi FW ortamıyla durulayın (200 μM Zn ile, pH 7.4) ve daha sonra 5 mM etilen glikol-bis (β-aminoetil eter)-N,N,N’, N’-tetraasetik asit (EGTA) tamponunu (pH 7.4) 5 dakika boyunca ekleyerek söndürerek, herhangi bir adsorbe 65Zn(II) kurtulmak için. Amino asit taşıma inhibitörü olan hetan-2 karboksilik asit (BCH) 10 mM 2-Aminobicyclo [2.2.1] varlığında veya yokluğunda hücreleri yukarıdaki ortam preparatlarına maruz bırakmayın. 15 dakikalık pozlama süresinden sonra, 3.4.8 ve 3.4.9 adımlarını tekrarlayın. RtgutGC hücreleri tek katmanlı olarak kuyuların dibine yapışacak. %0,2 sıcak sodyum dodecyl sülfat (SDS) deterjan (100 μL/kuyu) kullanarak hücreleri sindirin.NOT: SDS çözeltisinin kullanılmadan önce 90 °C’ye ayarlanmış bir su banyosuna 1 saat boyunca yerleştirilmesi gerekir. Hücreyi 1,5 mL’lik bir tüpe sindirin ve kurtarın. Gama sayacı kullanarak hücre özetlerinin radyoaktivitesini ölçün.NOT: Dakika başına sayımların (cpm) radyoaktif bozulma, arka plan etkinliği için düzeltilmesi gerekir ve Glover ve Hogstrand13tarafından açıklanan formülleri izleyerek belirli aktivite hesaplamalarına tabi tutulur. Hücrelerin protein konsantrasyonlarını ölçmek için, hücreleri 500 μL 0,5 M NaOH ile homojenize edin. Standart olarak sığır serum albümin (BSA) ile hücre örneğindeki protein konsantrasyonu ölçmek için bir Bradford test kiti kullanın.NOT: Protein konsantrasyonu ölçüldükten sonra, RTgutGC hücrelerinin Zn alım oranı pmoles Zn min-1 mg-1 protein olarak ifade edilebilir. 4. Atlantik somonunda diyet Zn’nin görünür kullanılabilirliği (Salmo salar) NOT: Atlantik somon yemleri, esas olarak bitki bazlı bileşenlerden (%5’e kadar balık proteini, balık yağı, bitki bazlı protein ve bitki yağı) protein kaynakları içeren ticari yemlere dayanarak formüle edilmiştir. İki yem, 150 mg / kg yem Zn konsantrasyonu elde etmek için inorganik bir kaynak (Zn sülfat) veya organik bir kaynak (Zn glisin şelat) ile desteklenmiştir. Ek olarak, belirgin kullanılabilirlik katsayısının hesaplanmasını sağlamak için atıl işaretleyici olarak yemlere% 0.01 oranında Yttrium oksit (yem sınıfı) eklendi. Atlantik somonunu (SalmoBreed suşu, yaş 1+ yıl, karma cinsiyet grupları) balıklar deneysel koşullara alışana kadar kendi tanklarında iklimlendir. Günlük yem alımlarını izleyerek Atlantik somonunun birliğini değerlendirin.NOT: Bu deneme üç taraflı tanklarda yapıldı, böylece toplam altı tank kullanıldı. Besleme denemesi sırasında su sıcaklığı 11.9 ± 0.3 °C ve çözünmüş oksijen doygunluğu % 101 ±. Balıkları 11 gün boyunca deneysel yemlerle besleyin. Litre su başına 6 mL trikain metanülfonat stok çözeltisi kullanarak balığı aşırı dozda ötenazi edin. Ventral yüzgecinden anüse kadar şeritlenerek aynı tanktan bir tabağa balıklardan havuzlanmış bir dışkı örneği toplayın. Dışkıyı bir spatula ile plakadan 50 mL konik bir tüpe çıkarın ve numuneleri hemen -20 ° C’de saklayın.NOT: Numuneler bir sonraki analize kadar -20 °C’de tutulmuştur. Dondurun dışkı örneklerini -80 °C’de 72 saat kurutun. Dışkı örneğini bir pestle ve harç kullanarak ince bir toz haline manuel olarak homojenize edin. ICP-MS kullanarak yem ve dışkı örneklerinde Zn ve Yttrium konsantrasyonunun belirlenmesi (başka bir yerde açıklandığı gibi9). Aşağıdaki formülü kullanarak görünür kullanılabilirlik katsayısını (AAC, %) belirleyin: