Este artículo explica en detalle un enfoque sistemático para evaluar la disponibilidad de microminerales en el salmón del Atlántico. La metodología incluye herramientas y modelos con complejidad biológica creciente: (1) análisis de especiación química, (2) solubilidad in vitro, (3) estudios de captación en líneas celulares y (4) estudios de peces in vivo.
Evaluar la disponibilidad de microminerales dietéticos es un desafío importante en la nutrición mineral de las especies de peces. El presente artículo tiene como objetivo describir un enfoque sistemático que combina diferentes metodologías para evaluar la disponibilidad de zinc (Zn) en el salmón del Atlántico(Salmo salar). Teniendo en cuenta que varias especies químicas de Zn pueden estar presentes en un alimento para salmón del Atlántico, se hipotetizó que la disponibilidad de Zn está influenciada por las especies químicas de Zn presentes en el alimento. Por lo tanto, en este estudio, el primer protocolo trata sobre cómo extraer las diferentes especies químicas de Zn del alimento y analizarlas mediante un método de cromatografía de exclusión de tamaño-espectroscopia de masas de plasma acoplado inductivamente (SEC-ICP-MS). Posteriormente, se desarrolló un método in vitro para evaluar la solubilidad del Zn dietético en los alimentos para salmones del Atlántico. El tercer protocolo describe el método para estudiar el impacto del cambio en la composición de especies químicas de Zn en la absorción de Zn en un modelo epitelial intestinal de peces utilizando una línea celular intestinal de trucha arco iris (RTgutGC). Juntos, los hallazgos de los métodos in vitro se compararon con un estudio in vivo que examinó la aparente disponibilidad de fuentes inorgánicas y orgánicas de Zn suplementadas con alimentos para salmón del Atlántico. Los resultados mostraron que se pueden encontrar varias especies químicas de Zn en los alimentos y la eficiencia de una fuente orgánica de Zn depende en gran medida del ligando de aminoácidos utilizado para quelar Zn. Los hallazgos de los métodos in vitro tuvieron menos correlación con el resultado del estudio in vivo. Sin embargo, los protocolos in vitro descritos en este artículo proporcionaron información crucial sobre la disponibilidad de Zn y su evaluación en los alimentos para peces.
La harina y el aceite de pescado se usaban tradicionalmente en la alimentación del salmón del Atlántico. Sin embargo, estos ingredientes están siendo reemplazados cada vez más por ingredientes de origen vegetal1. El cambio antes mencionado en la composición del alimento ha resultado en una baja disponibilidad dietética y una mayor necesidad de mejorar la disponibilidad de minerales en los alimentos para salmón del Atlántico, especialmente zinc (Zn)2. La disponibilidad reducida podría ser el resultado de un cambio en el nivel de Zn, las especies químicas de Zn y/o los factores antinutricionales presentes en la matriz de alimentación. En este escenario, ha surgido una nueva gama de aditivos considerados genéricamente como “fuentes orgánicas” con el potencial de ser una mejor fuente disponible de minerales dietéticos para los peces. Por lo tanto, es importante comprender la química y la fisiología fundamentales que rigen la disponibilidad de minerales y sus fuentes para los peces. El zinc es un oligoelemento esencial para todos los organismos vivos3. El papel del Zn como molécula de señalización se ha descrito tanto a nivel paracelular como intracelular en peces4. En el salmón del Atlántico, la deficiencia de Zn se ha asociado con anomalías esqueléticas y actividad reducida de varias metaloenzimas de Zn5,6.
Este estudio describe un enfoque sistemático para comprender la disponibilidad de Zn clasificándolo en cuatro compartimentos diferentes de complejidad química y biológica variada. Los métodos involucrados se describen en cuatro secciones, como se puede ver en la Figura 1:(1) evaluación de especies químicas de Zn en la fracción soluble de un alimento para salmón del Atlántico utilizando un método de cromatografía de exclusión de tamaño-espectroscopia de masas de plasma acoplado inductivamente (SEC-ICP-MS)7; (2) solubilidad in vitro del Zn suplementado en los piensos para salmón del Atlántico; (3) evaluación de la absorción de especies químicas de Zn por modelo intestinal in vitro (RTgutGC)8; y (4) disponibilidad aparente de Zn en salmón del Atlántico (Salmo salar)9. Se pueden desarrollar protocolos similares para otros minerales (por ejemplo, manganeso, selenio, cobre) de interés nutricional para las especies de peces de acuicultura.
La absorción intestinal de Zn parece estar influenciada por la forma química de la especie Zn13. En este sentido, el uso de los protocolos descritos en este artículo permitió el estudio secuencial de los aspectos químicos y biológicos subyacentes a la “disponibilidad” de Zn en el salmón del Atlántico.
Este estudio informó el uso de un método de análisis de especiación de Zn. El método SEC-ICP-MS proporcionó datos cualitativos sobre el peso molecular de las especies químicas de Zn presentes en la fracción soluble de un alimento para salmón del Atlántico. Esto se logró comparando los tiempos de retención de los estándares de calibración de peso molecular (es decir, tiroglobulina (660 kDa), superóxido dismutasa Zn/Cu (32 kDa), mioglobina (17 kDa) y vitamina B12 (1,36 kDa)) con los tiempos de retención de picos que contienen Zn. Un desafío encontrado en el análisis de especiación de Zn fue la identificación de las especies químicas desconocidas de Zn debido a la falta de estándares analíticos. En SEC, la separación de las moléculas se basa en sus tamaños en relación con los poros en la fase estacionaria. En principio, las moléculas más grandes viajarán más rápido, eluyendo primero, y las moléculas más pequeñas viajarán más lentamente, eluiendo más tarde14. En consecuencia, cada pico de Zn que contiene podría contener varios compuestos con un peso molecular similar15. Esto también contribuye al desafío de identificar especies químicas desconocidas de Zn. Además, se probaron varias condiciones de extracción suaves para la extracción de Zn. El Zn extraído fue bajo (~10%). Se aplicaron condiciones de extracción suaves para mantener intactas las especies químicas de Zn, pero esto puede haber comprometido la eficiencia de extracción7.
En el ensayo de solubilidad in vitro, la solubilidad del Zn suplementado (como radioisótopo 65ZnCl2)indicó que los aminoácidos, especialmente la histidina y la lisina, aumentaron la solubilidad del Zn (Figura 5). El uso de muestras de alimentación directamente para ensayos de solubilidad in vitro en condiciones gastrointestinales simuladas se basa en el conocimiento de que el cambio en la especiación de Zn depende del pH16. Sin embargo, las condiciones ácidas al comienzo del tracto gastrointestinal pueden dar lugar a algún cambio en la especiación que podría ser irreversible (por ejemplo, ZnO -> ZnCl2,en presencia de HCl en condiciones ácidas en el estómago). Sin embargo, la fuente de Zn utilizada aquí es ZnSO4 y su solubilidad fue mejorada por aminoácidos en el medio. La siguiente pregunta a responder fue, ¿se puede traducir el aumento de la solubilidad en disponibilidad? Se utilizó la línea celular intestinal RTgutGC para estudiar esta cuestión. En el contexto de la nutrición mineral en animales, el término “disponibilidad” es difícil de definir y puede regularse diferencialmente en las células (in vitro) en comparación con un animal (in vivo). Por lo tanto, el término “absorción” se utilizó cuando se trataba de la evaluación in vitro utilizando una línea celular intestinal. La línea celular proporcionó información útil sobre los mecanismos de absorción de Zn en el epitelio intestinal, que es parte del complejo proceso regulador que rige la disponibilidad de minerales en los animales. Las células RTgutGC provocaron una mejor capacidad para la absorción apical de Zn en presencia de un aminoácido (es decir, metionina; Figura 6). Sin embargo, la disponibilidad aparente in vivo no difirió significativamente entre las fuentes de Zn inorgánicas y orgánicas en el salmón del Atlántico. En el estudio de disponibilidad in vivo, la comparación de la fuente de Zn se realizó a niveles dietéticos de Zn que exceden con creces los requisitos conocidos de Zn del salmón del Atlántico17,concentración total de Zn de 150 mg / kg de alimento. Las diferencias en la disponibilidad se visualizan mejor cuando los niveles dietéticos probados caen en el rango dinámico lineal antes de que el animal alcance la saturación. En el presente estudio in vivo, es posible que el salmón del Atlántico estuviera bien saturado para observar la diferencia en la absorción de Zn entre las fuentes utilizadas.
En resumen, el primer método proporcionó información cualitativa sobre diferentes especies químicas de Zn que se encuentran en la fracción soluble de un alimento para salmón del Atlántico; el segundo método, la solubilidad in vitro del Zn suplementado se mejoró en presencia de ligandos de aminoácidos; el tercer método confirmó que la mejora de la solubilidad por aminoácidos puede mejorar la absorción en el epitelio intestinal; por el contrario, el cuarto método no logró encontrar diferencias en la disponibilidad de Zn de fuente inorgánica u orgánica al salmón del Atlántico. Para concluir, aunque no están alineados con los hallazgos in vivo, los protocolos in vitro proporcionaron información interesante para comprender los diferentes componentes de la disponibilidad de Zn.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo se realizó en el marco del proyecto APREMIA (Aparente disponibilidad y requerimiento de minerales en el salmón del Atlántico, subvención nº 244490) financiado por el Consejo Noruego de Investigación.
0.45 µm syringe filter | Sartorius | ||
0.45 μm membrane filter | Pall | ||
10 % fetal bovine serum | Eurobio | ||
1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter | LKB Wallac | ||
24 well plates (Falcon, TPP microplates) | Thermo Fisher Scientific | 10048760 | |
2-aminobicyclo(2.2.1)heptane-2-carboxylic acid | Sigma Aldrich | A7902 | |
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks) | TPP Techno Plastic Products AG | 90075 | |
L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
Bradford assay kit | Bio-Rad | 5000001 | |
Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5702 | ||
L-Cysteine | Sigma Aldrich | 30089 | |
DL-methionine | Alfa Aesar | 59-51-8 | |
D-methionine | Sigma Aldrich | M9375 | |
Experimental fish feeds | Skretting | ||
Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
Guard column, TSKgel SWxl Type (7 μm particle size) | Tosoh | ||
L-Histidine | Sigma Aldrich | 53319 | |
HPLC coupled with a 7500ce ICP-MS | Agilent Technologies | ||
Hydrochloric acid | Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck | 1.00317 | |
Knife mill | GM 300, Retsch Gmbh | ||
L-15 medium | Invitrogen/Gibco | 21083027 | |
L-methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
L-Lysine | Sigma Aldrich | 23128 | |
Methanol | LiChrosolv, HPLC grade, Merck | 1.06035 | |
Milli-Q water (18.2 MΩ cm) | EMD Millipore Corporation | ||
Myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
NexION 350D ICP-MS | Perkin Elmer | ||
Pasteur pipette | VWR | ||
pH meter | inoLab | ||
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | 806552 | |
RTgutGC cells | Obtained in kind from Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Switzerland | ||
SEC column, TSKgel G3000SWxl | Tosoh | ||
Sieve stainless steel (850 μm – 1.12 mm) | Retsch | ||
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | 436143 | |
Superoxide dismutase | Sigma Aldrich | S7571 | |
Thyroglobulin | Sigma Aldrich | T1001 | |
Tricaine methanesulphonate | PharmaQ | ||
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
Trypsin in 0.25% in phosphate-buffer saline | Biowest | L0910 | |
Versene EDTA solution | Invitrogen/Gibco | 15040-033 | |
Vitamin B12 | Sigma Aldrich | V2876 | |
Zinc chelate of glycine | Phytobiotics | ||
Zinc sulphate | Vilomix |