Bewertung der Verfügbarkeit von Mineralien in Fischfuttermitteln mit komplementären Methoden, die am Beispiel von Zink im Atlantischen Lachs demonstriert wurden

Der Fütterungsversuch in Abschnitt 4 wurde gemäß norwegischer (FOR-2015-06 – 18-761) und europäischer Gesetzgebung (Richtlinie 2010/63/EU) durchgeführt. 1. Bewertung von Zn-Chemischen Spezies in der löslichen Fraktion eines atlantischen Lachsfutters mit einer SEC-ICP-MS-Methode Extraktionspuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,5) Bereiten Sie den Extraktionspuffer vor, indem Sie eine angemessene Menge Tris(hydroxymethyl)aminomethan auflösen, um die gewünschte Ionenstärke (100 mM) in hochreinemH2Ozu erreichen. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit HCl-Lösung auf pH 8,5 ein und überwachen Sie die pH-Änderung mit einem pH-Messgerät. Vorbereitung von FutterprobenHINWEIS: Die verwendete Futterprobe wurde auf der Grundlage von kommerziellem Futter für Atlantischen Lachs formuliert, das Proteinquellen hauptsächlich aus pflanzlichen Inhaltsstoffen enthält (d. H. Ca. 5% Fischprotein, 10% Fischöl, 68% pflanzliches Protein und 12% pflanzliches Öl). Zinksulfat wurde dem Futter zugegänkt. Mahlen Sie die Futterprobe von Hand mit einem Stößel und einem Mörser. Sieben Sie die Futterprobe, um sicherzustellen, dass die Extraktion in einer Futterfraktion mit ähnlicher Partikelgröße (von 850 μm bis 1,12 mm) durchgeführt wird. Fahren Sie mit der Zn-Extraktion fort. Zinkextraktion aus einer Futterprobe Wiegen Sie ca. 0,5 g Futter in dreifacher Ausfertigung in 15 mL konische Röhrchen. Fügen Sie den Extraktionspuffer (5 ml 100 mM Tris-HCl, pH 8,5) zu den Proben hinzu. Extrahieren Sie die Proben in einem Rotator (20 U/ min) bei 4 °C für 24 h. Trennen Sie die löslichen und nicht löslichen Fraktionen durch Zentrifugation für 10 min bei 3000 x g. Verwenden Sie einen 0,45 μm Einwegspritzenfilter, um die lösliche Fraktion zu filtern. Die gefilterten Proben in saubere Röhrchen überführen. Führen Sie die Zn-Speziationsanalyse in den löslichen Fraktionen mit SEC-ICP-MS durch, wie in Schritt 1.6 beschrieben.HINWEIS: Eine Zusammenfassung des Verfahrens zur Zn-Extraktion aus einer Futterprobe ist in Abbildung 2beschrieben. Mobile Phasenlösung (50 mM Tris-HCl + 3% MeOH, pH 7,5) Die mobile Phasenlösung löst 6,057 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan in 1 L 3%iger MeOH-Lösung (v/v). Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf pH auf 7,5 mit HCl-Lösung ein und überwachen Sie die pH-Änderung mit einem pH-Messgerät. Filtern Sie die mobile Phasenlösung durch einen 0,45 μm Membranfilter. Molekulargewichtskalibrierung des SEC-Säulentrennbereichs Kalibrieren Sie den Trennbereich durch eine Molekulargewichtskalibrierung.HINWEIS: In dieser Studie wurden Thyreoglobulin (660 kDa), Zn/Cu-Superoxiddismutase (32 kDa), Myoglobin (17 kDa) und Vitamin B12 (1,36 kDa) verwendet. Bereiten Sie jeden der Standards mit einer bekannten Konzentration in hochreinemH2Ovor. Bereiten Sie eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) Durchstechflasche vor, indem Sie 250 μL Standard in eine Durchstechflasche geben. Laden Sie die Fläschchen mit Standards in den Sequenzlauf der Proben. Führen Sie die Molekulargewichtskalibrierung zu Beginn und am Ende der Analysesequenz durch und überwachen Sie 127I (Thyreoglobulin), 66Zn (Zn / Cu-Superoxiddismutase), 57Fe (Myoglobin) und 59Co (Vitamin B12).HINWEIS: Die Molekulargewichtskalibrierung wird gleichzeitig mit der Zn-Speziationsanalyse durchgeführt. Zink-Speziationsanalyse mit SEC-ICP-MSHINWEIS: Die Zn-Speziationsanalyse nach der SEC-ICP-MS-Methode wurde auf der Grundlage der an anderer Stelle beschriebenen Prinzipien10,11 entwickelt und für die Analyse eines atlantischen Lachsfutters7weiter optimiert. Führen Sie die Zn-Speziationsanalyse an den löslichen Fraktionen durch, indem Sie eine SEC-Säule (Size Exclusion Chromatography) und eine HPLC in Verbindung mit induktiv gekoppelter Plasmamassenspektroskopie (ICP-MS) verwenden. Bereiten Sie eine HPLC-Durchstechflasche vor, indem Sie 250 μL lösliche Fraktion zu einer Durchstechflasche hinzufügen. Vor der Analyse alle Proben mit 0,5 μL Vitamin B12 aufspießen. Dieser Schritt ermöglicht es, Verweilzeitenverschiebungen zu korrigieren und 59Co. zu überwachen. Die lösliche Fraktion mit Extraktionspuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,5) verdünnen und auf ein Endvolumen von 1 ml einstellen. Bereiten Sie den Sequenzlauf der Stichproben in zufälliger Reihenfolge vor. Stimmen Sie den ICP-MS gemäß den Anweisungen des Herstellers ab. Befolgen Sie die Geräteeinstellungen für HPLC und ICP-MS, um die Zn-Speziationsanalyse durchzuführen (siehe Tabelle 1). 2. In-vitro-Löslichkeit von ergänzten Zn in atlantischem Lachsfutter HINWEIS: Die verwendete Futterprobe wurde auf der Grundlage von kommerziellem Futter für Atlantischen Lachs formuliert, das Proteinquellen hauptsächlich aus pflanzlichen Zutaten enthält (d. H. Ca. 5% Fischmehl, 10% Fischöl, 68% pflanzliche Zutaten und 12% Pflanzenöl). Die Futterproben des Atlantischen Lachses für 10 s bei 3000 U/min mit einer Messermühle mahlen und bis zur weiteren Analyse bei 4 °C lagern. Wiegen Sie ~ 0,2 g der in Schritt 2.1 gemahlenen Futterproben und fügen Sie Zn-Radiotracer(65Zn) mit bekannter spezifischer Aktivität in ein Probenröhrchen mit 5 ml Volumen (mit einer Kappe) hinzu.ACHTUNG: Dieses Verfahren muss in einer Radionuklidsuite durchgeführt werden. Die Person, die diesen Schritt durchführt, sollte für den Umgang mit Radioisotopen geschult und zertifiziert sein. Die von der Strahlenschutzverwaltung des Instituts empfohlenen Sicherheits- und Vorsichtsmaßnahmen sind strikt zu beachten. Bereiten Sie dann die Süßwasser-Darm-Luminalpufferlösung wie unten beschrieben vor. Für Salzlösung A werden 11,65 gNaNO3, 0,55 g KNO3 und 0,4 g MgSO4gewogen. Die Salze in hochreinemH2O auflösen und auf ein Endvolumen von 60 ml einstellen. Für Salzlösung B 0,31 g Ca(NO3)2· 4 H2O.Die Salze in hochreinemH2O auflösen und auf ein Endvolumen von 10 ml einstellen. Verwenden Sie 500 mM HEPES-Stammlösung als Salzlösung C. Für Salzlösung D 1,2 gMgCl2 wiegen,das Salz in hochreinemH2O auflösen und auf ein Endvolumen von 20 ml einstellen. Für Salzlösung E 0,9 gMgSO4 wiegen,das Salz in hochreinemH2O auflösen und auf ein Endvolumen von 20 ml einstellen. Pyruvatlösung durch Lösen von 0,55 gCH3COCOONa in 10 ml hochreinemH2Ovorbereiten. 0,9 g Galactose (C6H12O6) werden in hochreinemH2Ogelöst. Mit einem Magnetrührer gut auflösen und Salzlösungen A, B, D und E durch Autoklavieren sowie Lösung C, Pyruvat und Galactose durch Filtration durch einen 200 μm Spritzenfilter sterilisieren. Nach der Herstellung der verschiedenen Stammlösungen, um 100 ml Arbeitslösung des Puffers zu erhalten, mischen Sie die oben hergestellten Lösungen in folgendem Verhältnis: 6,8 ml Salzlösung A, 4,14 ml B, 5 ml C, 2,5 ml D, 1,5 ml E und jeweils 1,14 ml Pyruvat und Galactose. Machen Sie das Volumen mit entionisiertem Wasser auf 100 ml.HINWEIS: Der obige Puffer stellt nun die ionische Zusammensetzung des Darmlumens dar, das in Süßwassersmosiden gefunden wird. Bereiten Sie sechs weitere Aliquoten des in Schritt 2.6 beschriebenen Puffers vor und fügen Sie eine der folgenden Aminosäuren (Cystein, Methionin, Glycin, Histidin, Lysin und Arginin) hinzu, um eine endgültige Molkonzentration von 5 mM zu erreichen. Der Süßwasser-Darm-Luminalpuffer (Reaktionsvolumen = 3 mL; pH 7,4) wird der Futterprobe zugefügen. Wiederholen Sie Schritt 2.5 mit den in 2.4 beschriebenen Puffern (in Gegenwart verschiedener Aminosäuren bei einer Konzentration von 5 mM). Schließen Sie die Rohre und lassen Sie sie in einem Drehspinner für 30 min bei 25 U / min drehen. Trennen Sie die löslichen und unlöslichen Fraktionen durch Zentrifugal für 10 min bei 1157 x g. Verwenden Sie einen Gamma-Kassierer, um die Anzahl pro Minute (cpm) von 65Zn in den löslichen und nicht löslichen Fraktionen zu messen. Berechnen Sie den Anteil der Radioisotope von Zn (65Zn), die in den löslichen und nicht löslichen Fraktionen vorhanden sind. 3. Bewertung der Aufnahme chemischer Zn-Spezies mit einem In-vitro-Darmmodell (RTgutGC) RTgutGC-ZellkulturHINWEIS: Alle in diesem Schritt verwendeten Arbeitsmaterialien sollten steril sein. Beleben Sie die gefrorenen RTgutGC-Zellen sanft in einem bei 20 °C eingestellten Wasserbad. Pipetten Sie die Lösung, die die Zellen enthält, vorsichtig aus und suspendieren Sie sie in 10 ml L15-Medium mit 10% fetalem Rinderserum (FBS).HINWEIS: 10% FBS wird nur zur Wiederbelebung der gefrorenen Zellen verwendet. Für die anschließende Passage wird FBS zu 5% verwendet. Die Zusammensetzung von FBS kann zwischen den Chargen variieren, daher ist es ratsam, so viel wie nötig von einer einzigen Charge zu kaufen und zu lagern, um Variationen zwischen den Chargen in der Serumzusammensetzung zu vermeiden. Die Zellsuspension in 75 cm2 Zellkulturkolben geben und in einem bei 19 °C eingestellten Inkubator unter normaler Atmosphäre inkubieren. Überprüfen Sie die Zellen und teilen Sie die Zellen bei Konfluenz (80% Konfluenz, beurteilen Sie visuell, indem Sie die Dichte der Zelloberfläche unter einem Mikroskop untersuchen), teilen Sie die Zellen in neue Kolben (nachfolgende Passage) oder ernten Sie sie, um sie in Experimenten zu verwenden.HINWEIS: Ein Beispiel für die RTgutGC-Zellen 1 h und 1 Woche nach der Aussaat in die Zellkulturkolben ist in Abbildung 3 dargestellt. Zellernte und Vorbereitung auf Expositionsexperimente Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 ml Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Lösung. Nach jeder Wäsche saugen Sie die EDTA-Lösung mit einem sterilen Saugrohr ab. Behandeln Sie die Zellen mit Trypsin (0,7 ml Trypsin, in 0,25% in phosphatgepufferter Kochsalzlösung [PBS]). Drehen Sie den Kolben vorsichtig in spitzen Winkeln, um das Trypsin entlang der gesamten Oberfläche des Kolbens zu verteilen. Setzen Sie die Rotation für 2 Minuten fort, während sich die Zellen lösen. Nach 2 min vorsichtigem Drehen 10 ml L15/FBS-Medium hinzufügen, um Trypsin zu neutralisieren. Dekantieren Sie die resultierende Zellsuspension mit einer sterilen Pipette und Zentrifuge für 3 min bei 130 x gin ein konisches Bodenzentrifugenröhrchen. Bestimmen Sie die Dichte der geernteten Zellen durch manuelles Zählen mit Hämozytometer. Fügen Sie das erforderliche Volumen von L15 / FBS-Medium hinzu, um eine Zelldichte von 5 x 104 Zellen / ml zu erreichen. Säen Sie die Zellen auf 24-Well-Platten, indem Sie 1 ml Zellsuspension pro Vertiefung pipettieren, um die endgültige Zelldichte von 5 x 104 Zellen / Well zu erreichen.HINWEIS: Verwenden Sie vorzugsweise Multi-Dispensing-Pipetten, um Variationen zu minimieren und die Zeit zu verkürzen. Legen Sie die ausgesäten Platten vor den Experimenten 48 h lang in einen Inkubator unter normaler Atmosphäre bei 19 °C.HINWEIS: Trypsin bei -20 °C zu lagern; EDTA-Lösung und L15/FBS-Medien bei 4 °C. Stellen Sie die Temperatur aller Arbeitslösungen und Medien kurz vor Gebrauch auf 19 °C ein. Aufbereitung von Belichtungsmedien HINWEIS: Dieser Schritt muss unter dem Abzug unter aseptischen und sterilen Bedingungen durchgeführt werden. L15/ex werden durch Mischen von 6,8 ml Salzlösung A (Schritt 2.3.1), 1,14 ml B (Schritt 2.3.2), 5 ml C (Schritt 2.3.3) und je 1,14 ml Pyruvat (Schritt 2.3.6) und Galactose (Schritt 2.3.7) zubereitet. Machen Sie das Volumen mit sterilem destilliertem Wasser in Zellkulturqualität auf 100 ml auf. FW wird durch Mischen von 6,8 ml Salzlösung A (2.3.1), 4,14 ml B (2.3.2), 5 ml C (2.3.3), 2,5 ml D (2.3.4), 1,5 ml E (2.3.5) und jeweils 1,14 ml Pyruvat (2.3.6) und Galactose (2.3.7) zubereitet. Machen Sie das Volumen mit sterilem, zellkulturiertem destilliertem Wasser auf 100 ml auf. Quantifizierung der Ionenkonzentrationen in den Expositionsmedien mit ICP-MS, wie an anderer Stelle beschrieben12.HINWEIS: Die in den Medienpräparaten analysierten Ionenkonzentrationen sind in Tabelle 2 dargestellt. Zink(65Zn) Influx Assays Säen Sie die RTgutGC-Zellen auf 24-Well-Platten (5 x10 4 Zellen/Well) in vollständigem L15/FBS-Medium. 48 h in einem Inkubator mit normaler Atmosphäre bei 19 °C inkubieren. Alle experimentellen Medienpräparate werden mit 0,5 M NaOH in Gegenwart oder Abwesenheit von L-Methionin (L-Met) oder DL-Methionin (DL-Met) bei einer Konzentration von 2 mM auf pH 7,4 eingestellt.HINWEIS: Die in 3.4.3 beschriebene pH-Einstellung der Puffer muss vor der Behandlung der Zellen in Schritt 3.4.5 frisch erfolgen. Nach Abschluss der Inkubationszeit das Medium aus den Vertiefungen entfernen und gründlich mit PBS abspülen. Fügen Sie das pH-eingestellte FW-Experimentiermedium hinzu und lassen Sie es 20 Minuten lang akklimatisieren. Setzen Sie die RTgutGC-Zellen in den in Schritt 3.4.3 beschriebenen Medien Nominalkonzentrationen von 3,07, 6,14, 12,27 und24,55 μM 65Zn(II) (als ZnCl 2; ~4 kBq/ml) aus. Unmittelbar danach die Zellen im Inkubator für 15 min bei 19 °C aufbewahren. Nachdem die 15-minütige Inkubation beendet ist, saugen Sie den Kulturüberstand an und entfernen Sie ihn aus dem Brunnen. Spülen Sie die Zellen mit eiskaltem FW-Medium (mit 200 μM Zn, pH 7,4) und löschen Sie dann durch Zugabe des 5 mM Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N’,N’-Tetraessigsäure (EGTA)-Puffers (pH 7,4) für 5 min, um adsorbierte 65Zn(II) loszuwerden. Setzen Sie die Zellen den oben genannten Medienpräparaten in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 mM 2-Aminobicyclo [2.2.1] Heptan-2-carbonsäure (BCH), einem Aminosäuretransportinhibitor, aus. Wiederholen Sie nach der Expositionszeit von 15 minuten die Schritte 3.4.8 und 3.4.9. Die RtgutGC-Zellen werden als Monoschicht am Boden der Vertiefungen haften. Verdauen Sie die Zellen mit 0,2% heißem Natriumdodecylsulfat (SDS) Reinigungsmittel (100 μL / Well).HINWEIS: Die SDS-Lösung muss vor gebrauchen 1 h in einem auf 90 °C eingestellten Wasserbad platziert werden. Saugen Sie den Zellferment ab und gewinnen Sie es in ein 1,5 ml Röhrchen zurück. Messen Sie die Radioaktivität der Zellverdauungen mit einem Gammazähler.HINWEIS: Die Zählungen pro Minute (cpm) müssen für radioaktiven Zerfall und Hintergrundaktivität korrigiert werden und werden spezifischen Aktivitätsberechnungen nach den von Glover und Hogstrand13beschriebenen Formeln unterzogen. Um die Proteinkonzentration der Zellen zu quantifizieren, homogenisieren Sie die Zellen mit 500 μL von 0,5 M NaOH. Verwenden Sie ein Bradford-Assay-Kit, um die Proteinkonzentration in der Zellprobe zu messen, wobei Rinderserumalbumin (BSA) als Standard verwendet wird.HINWEIS: Sobald die Proteinkonzentration quantifiziert ist, kann die Zn-Aufnahmerate durch RTgutGC-Zellen als Pmolen Zn min-1 mg-1 Protein exprimiert werden. 4. Scheinbare Verfügbarkeit von nahrungsfreiem Zn im Atlantischen Lachs (Salmo salar) HINWEIS: Die atlantischen Lachsfuttermittel wurden auf der Grundlage kommerzieller Futtermittel formuliert, die Proteinquellen hauptsächlich aus pflanzlichen Zutaten enthalten (d. H. Ca. 5% Fischprotein, 10% Fischöl, 68% pflanzliches Protein und 12% Pflanzenöl). Zwei Futtermittel wurden mit einer anorganischen Quelle (Zn-Sulfat) oder einer organischen Quelle (Zn-Glycinchelat) ergänzt, um eine Zn-Konzentration von 150 mg/kg Futter zu erreichen. Zusätzlich wurde dem Futter Yttriumoxid (Feed Grade) mit 0,01% als inerter Marker zugesetzt, um die Berechnung des scheinbaren Verfügbarkeitskoeffizienten zu ermöglichen. Akklimatisieren Sie den Atlantischen Lachs (SalmoBreed-Stamm, Alter 1+ Jahre, gemischtgeschlechtliche Gruppen) in ihren jeweiligen Becken, bis die Fische an die Experimentellenbedingungen gewöhnt sind. Beurteilen Sie die Akklimatisierung des Atlantischen Lachses, indem Sie ihre tägliche Futteraufnahme überwachen.HINWEIS: Dieser Versuch wurde in dreifachen Tanks durchgeführt, so dass insgesamt sechs Panzer verwendet wurden. Während des Fütterungsversuchs betrug die Wassertemperatur 11,9 ± 0,3 °C und die Sättigung des gelösten Sauerstoffs betrug 101 ± 5%. Füttern Sie die Fische 11 Tage lang mit experimentellen Fütterungen. Euthanisieren Sie die Fische durch Überdosierung mit 6 ml Tricainmethansulfonat-Stammlösung pro Liter Wasser. Sammeln Sie eine gepoolte Kotprobe aus dem Fisch aus demselben Becken in eine Platte, indem Sie von der Bauchflosse zum Anus streifen. Entfernen Sie den Kot von der Platte mit einem Spatel in ein 50 ml konisches Röhrchen und lagern Sie die Proben sofort bei -20 °C.HINWEIS: Die Proben wurden bis zur weiteren Analyse bei -20 °C gehalten. Gefriertrocknung der Kotproben für 72 h bei -80 °C. Homogenisieren Sie die Kotprobe manuell zu einem feinen Pulver mit einem Stößel und Mörser. Bestimmen Sie die Konzentration von Zn und Yttrium in den Futter- und Kotproben mit einem ICP-MS (wie an anderer Stelle beschrieben9). Bestimmen Sie den Koeffizienten für die scheinbare Verfügbarkeit (AAC, %) mit der folgenden Formel: