Évaluation de la disponibilité des minéraux dans les aliments pour poissons à l’aide de méthodes complémentaires démontrées par l’exemple du zinc dans le saumon de l’Atlantique

L’essai d’alimentation de la rubrique 4 a été réalisé conformément à la législation norvégienne (FOR-2015-06 – 18-761) et européenne (directive 2010/63/UE). 1. Évaluation des espèces chimiques de Zn dans la fraction soluble d’un aliment pour saumon de l’Atlantique à l’aide d’une méthode SEC-ICP-MS Tampon d’extraction (100 mM Tris-HCl, pH 8,5) Préparer le tampon d’extraction en dissolvant une quantité appropriée de tris(hydroxyméthyl)aminométhane pour atteindre la force ionique souhaitée (100 mM) dansH2Oultrapur. Ajuster le pH de la solution à pH 8,5 avec la solution HCl, en surveillant le changement de pH avec un pH-mètre. Préparation d’échantillons d’aliments pour animauxREMARQUE : L’échantillon d’aliments utilisé a été formulé à partir d’aliments commerciaux pour saumon de l’Atlantique, contenant des sources de protéines provenant principalement d’ingrédients d’origine végétale (c.-à-d. environ 5 % de protéines de poisson, 10 % d’huile de poisson, 68 % de protéines végétales et 12 % d’huile végétale). Le sulfate de zinc a été complété par l’aliment. Broyer l’échantillon d’aliments à la main à l’aide d’un pilon et d’un mortier. Tamiser l’échantillon d’alimentation pour s’assurer que l’extraction est effectuée dans une fraction d’alimentation de taille de particules similaire (de 850 μm à 1,12 mm). Procédez à l’extraction Zn. Extraction du zinc à partir d’un échantillon d’alimentation Peser environ 0,5 g d’aliment en triple exemplaire dans des tubes coniques de 15 mL. Ajouter le tampon d’extraction (5 mL de 100 mM Tris-HCl, pH 8,5) aux échantillons. Extraire les échantillons dans un rotateur (20 tr/min) à 4 °C pendant 24 h. Séparer les fractions solubles et non solubles par centrifugation pendant 10 min à 3000 x g. Utilisez un filtre à seringue jetable de 0,45 μm pour filtrer la fraction soluble. Transférer les échantillons filtrés dans des tubes propres. Effectuer l’analyse de spéciation du Zn dans les fractions solubles à l’aide de SEC-ICP-MS, comme décrit à l’étape 1.6.REMARQUE : Un résumé de la procédure d’extraction du Zn à partir d’un échantillon d’alimentation est décrit à la figure 2. Solution de phase mobile (50 mM Tris-HCl + 3% MeOH, pH 7,5) Préparer la solution de phase mobile en dissolvant 6,057 g de tris(hydroxyméthyl)aminométhane dans 1 L de solution de MeOH à 3 % (v/v). Ajuster le pH de la solution à un pH de 7,5 avec la solution HCl, en surveillant le changement de pH avec un pH-mètre. Filtrer la solution de phase mobile à travers un filtre à membrane de 0,45 μm. Étalonnage en poids moléculaire de la plage de séparation des colonnes SEC Calibrer la plage de séparation en effectuant un étalonnage de masse moléculaire.REMARQUE: Dans cette étude, la thyroglobuline (660 kDa), la superoxyde dismutase Zn / Cu (32 kDa), la myoglobine (17 kDa) et la vitamine B12 (1,36 kDa) ont été utilisées. Préparer chacune des étalons avec une concentration connue en H2O ultrapur. Préparer un flacon de chromatographie liquide à haute performance (CLHP) en ajoutant 250 μL d’étalon à un flacon. Chargez les flacons avec des étalons pour la séquence des échantillons. Effectuer l’étalonnage du poids moléculaire au début et à la fin de la séquence analytique, en surveillant 127I (thyroglobuline), 66Zn (superoxyde dismutase Zn/Cu), 57Fe (myoglobine) et 59Co (vitamine B12).REMARQUE: L’étalonnage du poids moléculaire est effectué simultanément avec l’analyse de spéciation Zn. Analyse de la spéciation du zinc à l’aide de SEC-ICP-MSNOTE: L’analyse de la spéciation du Zn par la méthode SEC-ICP-MS a été développée sur la base des principes décrits ailleurs10,11 et une optimisation supplémentaire a été effectuée pour l’analyse d’un aliment pour saumon de l’Atlantique7. Effectuer l’analyse de spéciation Zn sur les fractions solubles à l’aide d’une colonne de chromatographie d’exclusion de taille (SEC) et d’une CLHP couplée à une spectroscopie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS). Préparer un flacon HPLC en ajoutant 250 μL de fraction soluble à un flacon. Avant l’analyse, augmentez tous les échantillons avec 0,5 μL de vitamine B12. Cette étape permet de corriger les temps de rétention des quarts de travail, en surveillant 59Co. Diluer la fraction soluble avec un tampon d’extraction (100 mM Tris-HCl, pH 8,5) et ajuster à un volume final de 1 mL. Préparez l’exécution séquentielle des échantillons dans un ordre aléatoire. Réglez l’ICP-MS selon les instructions du fabricant. Suivez les paramètres de l’instrument pour la CLHP et l’ICP-MS en effectuant l’analyse de spéciation Zn (voir Tableau 1). 2. Solubilité in vitro du Zn supplémenté dans les aliments pour saumons de l’Atlantique REMARQUE : L’échantillon d’aliments utilisé a été formulé à partir d’aliments commerciaux pour le saumon de l’Atlantique, contenant des sources de protéines provenant principalement d’ingrédients d’origine végétale (c.-à-d. environ 5 % de farine de poisson, 10 % d’huile de poisson, 68 % d’ingrédients d’origine végétale et 12 % d’huile végétale). Broyer les échantillons d’aliments pour saumon de l’Atlantique pendant 10 s à 3000 tr/min à l’aide d’un broyeur à couteaux et conserver à 4 °C jusqu’à une analyse plus approfondie. Peser environ 0,2 g des échantillons d’alimentation broyés à l’étape 2.1 et ajouter le radiotraceur Zn(65Zn) d’activité spécifique connue dans un tube d’échantillon de volume de 5 mL (avec un bouchon).ATTENTION : Cette procédure doit être effectuée à l’intérieur d’une suite de radionucléides. La personne qui effectue cette étape doit être formée et certifiée pour manipuler les radio-isotopes. Les mesures de sécurité et de précaution conseillées par l’administration de la radioprotection de l’institut doivent être strictement suivies. Ensuite, préparez la solution tampon luminale intestinale d’eau douce comme décrit ci-dessous. Pour la solution saline A, peser 11,65 g de NaNO3,0,55 g de KNO3 et 0,4 g de MgSO4. Dissoudre les sels dans H2O ultrapur et ajuster à un volume final de 60 mL. Pour la solution saline B, peser 0,31 g de Ca(NO3)2· 4 H2O. Dissoudre les sels dans H2O ultrapur et ajuster à un volume final de 10 mL. Utiliser la solution mère HEPES de 500 mM comme solution saline C. Pour la solution saline D, peser 1,2 g deMgCl2,dissoudre le sel dans H2O ultrapur et ajuster à un volume final de 20 mL. Pour la solution saline E, peser 0,9 g deMgSO4,dissoudre le sel dansH2Oultrapur et ajuster à un volume final de 20 mL. Préparer la solution de pyruvate en dissolvant 0,55 g de CH3COCOONa dans 10 mL de H2Oultrapur. Dissoudre 0,9 g de galactose(C6H12O6)dans H2O ultrapur. Bien dissoudre à l’aide d’un agitateur magnétique et stériliser les solutions salines A, B, D et E par autoclavage, et la solution C, le pyruvate et le galactose par filtration à travers un filtre à seringue de 200 μm. Après préparation des différentes solutions types, pour préparer 100 mL de solution de travail du tampon, mélanger les solutions préparées ci-dessus dans la proportion suivante: 6,8 mL de solution saline A, 4,14 mL de B, 5 mL de C, 2,5 mL de D, 1,5 mL de E et 1,14 mL chacun de pyruvate et de galactose. Porter le volume à 100 mL en utilisant de l’eau désionisée.REMARQUE: Le tampon ci-dessus représentera maintenant la composition ionique de la lumière intestinale trouvée dans les salmonidés d’eau douce. Préparer six autres aliquotes du tampon décrit à l’étape 2.6 et ajouter l’un des acides aminés suivants (cystéine, méthionine, glycine, histidine, lysine et arginine) pour atteindre une concentration molaire finale de 5 mM. Ajouter le tampon luminal intestinal d’eau douce (volume de réaction = 3 mL; pH 7,4) à l’échantillon d’alimentation. Répétez l’étape 2.5 avec les tampons décrits au point 2.4 (en présence de différents acides aminés à une concentration de 5 mM). Fermez les tubes et laissez-les tourner dans une essoreuse rotative pendant 30 min à 25 tr/min. Séparer les fractions solubles et non solubles par centrifugation pendant 10 min à 1157 x g. Utilisez un guichet gamma pour mesurer les comptes par minute (cpm) de 65Zn dans les fractions solubles et non solubles. Calculer la proportion des radio-isotopes du Zn(65Zn) présents dans les fractions solubles et non solubles. 3. Évaluation de l’absorption des espèces chimiques Zn à l’aide d’un modèle intestinal in vitro (RTgutGC) Culture de cellules RTgutGCREMARQUE: Tous les matériaux de travail utilisés dans cette étape doivent être stériles. Faire revivre doucement les cellules RTgutGC congelées au bain-marie fixé à 20 °C. Pipeter doucement la solution contenant les cellules et les suspendre dans 10 mL de milieu L15 contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS).REMARQUE: 10% FBS n’est utilisé que pour raviver les cellules congelées. Pour le passage ultérieur, FBS est utilisé à 5%. La composition de FBS peut varier d’un lot à l’autre, il est donc conseillé d’acheter et de stocker autant que nécessaire à partir d’un seul lot pour éviter les variations inter-lots de la composition sérique. Ajouter la suspension cellulaire à 75 cm2 flacons de culture cellulaire et incuber dans un incubateur réglé à 19 °C sous atmosphère normale. Vérifiez les cellules et, lorsqu’elles sont confluentes (confluence à 80%, évaluez visuellement en examinant la densité de la surface cellulaire au microscope), divisez les cellules en nouvelles fioles (passage ultérieur) ou récoltez-les pour les utiliser dans des expériences.REMARQUE: Un exemple des cellules RTgutGC 1 h et 1 semaine après l’ensemencement dans les flacons de culture cellulaire est illustré à la figure 3. Récolte de cellules et préparation aux expériences d’exposition Laver les cellules deux fois avec 1 mL de solution d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Après chaque lavage, siphonner la solution d’EDTA à l’aide d’un tube d’aspiration stérile. Traiter les cellules avec de la trypsine (0,7 mL de trypsine, dans 0,25 % dans une solution saline tamponnée au phosphate [PBS]). Faites tourner doucement la fiole à des angles aigus pour répandre la trypsine tout le long de la surface de la fiole. Continuez la rotation pendant 2 min, pendant que les cellules se détachent. Après avoir tourné doucement pendant 2 min, ajouter 10 mL de milieu L15/FBS pour neutraliser la trypsine. Décanter la suspension cellulaire résultante dans un tube de centrifugeuse à fond conique à l’aide d’une pipette stérile et d’une centrifugeuse pendant 3 min à 130 x g. Déterminer la densité des cellules récoltées par comptage manuel à l’aide d’un hémocytomètre. Ajouter le volume requis de milieu L15/FBS pour atteindre une densité cellulaire de 5 x 104 cellules/mL. Ensemencez les cellules sur des plaques de 24 puits en pipetant 1 mL de suspension cellulaire par puits pour atteindre la densité cellulaire finale de 5 x 104 cellules/puits.REMARQUE: Utilisez de préférence des pipettes multi-distributions pour minimiser les variations et réduire le temps. Placer les plaques ensemencées dans un incubateur sous atmosphère normale à 19 °C pendant 48 h avant les expériences.REMARQUE: Trypsine à stocker à -20 °C; Solution EDTA et support L15/FBS à 4 °C. Réglez la température de toutes les solutions de travail et de tous les supports à 19 °C juste avant utilisation. Préparation des milieux d’exposition REMARQUE: Cette étape doit être effectuée sous la hotte dans des conditions aseptiques et stériles. Préparer L15/ex en mélangeant 6,8 mL de solution saline A (étape 2.3.1), 1,14 mL de B (étape 2.3.2), 5 mL de C (étape 2.3.3) et 1,14 mL chacun de pyruvate (étape 2.3.6) et de galactose (étape 2.3.7). Porter le volume à 100 mL à l’aide d’eau distillée stérile de qualité culture cellulaire. Préparer FW en mélangeant 6,8 mL de solution saline A (2.3.1), 4,14 mL de B (2.3.2), 5 mL de C (2.3.3), 2,5 mL de D (2.3.4), 1,5 mL de E (2.3.5) et 1,14 mL de pyruvate (2.3.6) et de galactose (2.3.7). Porter le volume à 100 mL à l’aide d’eau distillée stérile de qualité culture cellulaire. Quantifier les concentrations d’ions dans les milieux d’exposition à l’aide de l’ICP-MS comme décritailleurs 12.NOTE : Les concentrations ioniques analysées dans les milieux préparés sont présentées dans le tableau 2. Dosages d’afflux de zinc(65Zn) Ensemencez les cellules RTgutGC sur des plaques de 24 puits (5 x10 4 cellules/puits) dans un milieu L15/FBS complet. Incuber pendant 48 h dans un incubateur à atmosphère normale à 19 °C. Ajuster toutes les préparations expérimentales au pH 7,4 en utilisant 0,5 M de NaOH en présence ou en l’absence de L-méthionine (L-Met) ou de DL-méthionine (DL-Met) à une concentration de 2 mM.REMARQUE: L’ajustement du pH des tampons décrit au point 3.4.3 doit être effectué récemment avant le traitement des cellules à l’étape 3.4.5. Une fois la période d’incubation terminée, retirez le milieu des puits et rincez abondamment avec du PBS. Ajouter le milieu expérimental FW ajusté au pH et laisser s’acclimater pendant 20 min. Exposer les cellules RTgutGC à des concentrations nominales de 3,07, 6,14, 12,27 et 24,55 μM 65Zn(II) (sous forme de ZnCl2; ~4 kBq/mL) dans le milieu décrit à l’étape 3.4.3. Immédiatement après, maintenez les cellules dans l’incubateur à 19 °C pendant 15 min. Une fois l’incubation de 15 minutes terminée, aspirez le surnageant de culture et retirez-le du puits. Rincez les cellules avec un milieu FW glacé (avec 200 μM Zn, pH 7,4), puis éteignez-les en ajoutant le tampon d’acide tétraacétique (pH 7,4) de 5 mM d’éthylène glycol-bis(β-aminoéthylique)-N,N,N’,N’-tétraacétique (EGTA) pendant 5 min, pour se débarrasser de tout 65Zn(II) adsorbé. Exposer les cellules aux préparations de milieux ci-dessus en présence ou en l’absence de 10 mM d’acide 2-aminobicyclo [2.2.1] heptane-2-carboxylique (BCH), un inhibiteur du transport des acides aminés. Après la période d’exposition de 15 min, répétez les étapes 3.4.8 et 3.4.9. Les cellules RtgutGC seront collées au fond des puits en monocouche. Digérez les cellules à l’aide d’un détergent à 0,2 % de dodécylsulfate de sodium chaud (FDS) (100 μL/puits).REMARQUE: La solution SDS doit être placée pendant 1 h dans un bain-marie réglé à 90 ° C avant utilisation. Aspirer et récupérer le digestat cellulaire dans un tube de 1,5 mL. Mesurer la radioactivité des digestes cellulaires à l’aide d’un compteur gamma.REMARQUE: Les comptes par minute (cpm) doivent être corrigés pour la désintégration radioactive, l’activité de fond et sont soumis à des calculs d’activité spécifiques selon les formules décrites par Glover et Hogstrand13. Pour quantifier la concentration protéique des cellules, homogénéiser les cellules avec 500 μL de 0,5 M NaOH. Utilisez un kit de dosage Bradford pour mesurer la concentration en protéines dans l’échantillon cellulaire, avec l’albumine sérique bovine (BSA) comme norme.REMARQUE: Une fois la concentration en protéines quantifiée, le taux d’absorption de Zn par les cellules RTgutGC peut être exprimé en pmoles Zn min-1 mg-1 protéine. 4. Disponibilité apparente de Zn alimentaire dans le saumon de l’Atlantique (Salmo salar) REMARQUE : Les aliments pour saumon de l’Atlantique ont été formulés à partir d’aliments commerciaux, contenant des sources de protéines provenant principalement d’ingrédients d’origine végétale (c.-à-d. environ 5 % de protéines de poisson, 10 % d’huile de poisson, 68 % de protéines végétales et 12 % d’huile végétale). Deux aliments ont été complétés par une source inorganique (sulfate de Zn) ou une source organique (chélate de Zn de glycine) pour atteindre une concentration de Zn de 150 mg/kg d’aliment. De plus, de l’oxyde d’yttrium (qualité d’alimentation) a été ajouté à l’aliment à 0,01 % en tant que marqueur inerte pour permettre le calcul du coefficient de disponibilité apparente. Acclimater le saumon de l’Atlantique (souche SalmoBreed, âge 1+ ans, groupes mixtes) dans leurs bassins respectifs jusqu’à ce que les poissons soient habitués aux conditions expérimentales. Évaluer l’acclimatation du saumon de l’Atlantique en surveillant sa consommation quotidienne d’aliments.REMARQUE: Cet essai a été effectué dans des réservoirs triples, donc un total de six réservoirs ont été utilisés. Au cours de l’essai d’alimentation, la température de l’eau était de 11,9 ± 0,3 °C et la saturation en oxygène dissous était de 101 ± 5 %. Nourrissez les poissons avec des aliments expérimentaux pendant 11 jours. Euthanasier le poisson par surdosage en utilisant 6 mL de solution stock de méthanesulfonate de tricaïne par litre d’eau. Prélever un échantillon regroupé d’excréments du poisson du même aquarium dans une assiette en les rayant de la nageoire ventrale à l’anus. Retirer les matières fécales de la plaque à l’aide d’une spatule dans un tube conique de 50 mL et conserver immédiatement les échantillons à -20 °C.NOTE: Les échantillons ont été conservés à -20 °C jusqu’à une analyse plus approfondie. Lyophilisation des échantillons de matières fécales pendant 72 h à -80 °C. Homogénéiser manuellement l’échantillon de matières fécales en une poudre fine à l’aide d’un pilon et d’un mortier. Déterminer la concentration de Zn et d’Yttrium dans les échantillons d’aliments et de matières fécales à l’aide d’un ICP-MS (tel que décrit ailleurs9). Déterminer le coefficient de disponibilité apparente (CAA, %) à l’aide de la formule suivante :