Beoordeling van de beschikbaarheid van mineralen in visvoeders met behulp van aanvullende methoden die zijn aangetoond met het voorbeeld van zink in Atlantische zalm

De voedingsproef in sectie 4 werd uitgevoerd volgens de Noorse (FOR-2015-06 – 18-761) en Europese wetgeving (Richtlijn 2010/63/EU). 1. Evaluatie van chemische Zn-soorten in de oplosbare fractie van een Atlantisch zalmvoer met behulp van een SEC-ICP-MS-methode Extractiebuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,5) Bereid de extractiebuffer voor door een geschikte hoeveelheid tris(hydroxymethyl)aminomethaan op te lossen om de gewenste ionische sterkte (100 mM) te bereiken in ultrapeur H2O. Stel de pH van de oplossing in op pH 8,5 met de HCl-oplossing en controleer de pH-verandering met een pH-meter. Voorbereiding van voedermonstersOPMERKING: Het gebruikte voedermonster is geformuleerd op basis van commercieel voer voor Atlantische zalm, dat eiwitbronnen bevat die voornamelijk afkomstig zijn van plantaardige ingrediënten (d.w.z. ongeveer 5% viseiwit, 10% visolie, 68% plantaardig eiwit en 12% plantaardige olie). Zinksulfaat werd aangevuld met het voer. Maal het voermonster met de hand met behulp van een stamper en een vijzel. Zeef het voedingsmonster om ervoor te zorgen dat de extractie wordt uitgevoerd in een voedingsfractie met een vergelijkbare deeltjesgrootte (van 850 μm tot 1,12 mm). Ga verder met het uitvoeren van de Zn-extractie. Zinkextractie uit een voedermonster Weeg ongeveer 0,5 g voer in drievoud af in conische buisjes van 15 ml. Voeg de extractiebuffer (5 ml van 100 mM Tris-HCl, pH 8,5) toe aan de monsters. Pak de monsters in een rotator (20 rpm) bij 4 °C gedurende 24 uur. Scheid de oplosbare en niet-oplosbare fracties door centrifugering gedurende 10 minuten bij 3000 x g. Gebruik een wegwerpspuitfilter van 0,45 μm om de oplosbare fractie te filteren. Breng de gefilterde monsters over naar schone buizen. Voer de Zn-speciatieanalyse uit in de oplosbare fracties met SEC-ICP-MS, zoals beschreven in stap 1.6.OPMERKING: Een samenvatting van de procedure voor Zn-extractie uit een voedermonster wordt beschreven in figuur 2. Mobiele fase oplossing (50 mM Tris-HCl + 3% MeOH, pH 7,5) Bereid de mobiele faseoplossing voor het oplossen van 6,057 g tris(hydroxymethyl)aminomethaan in 1 l 3% MeOH-oplossing (v/v). Stel de pH van de oplossing in op 7,5 met de HCl-oplossing en controleer de pH-verandering met een pH-meter. Filter de mobiele fase-oplossing door een membraanfilter van 0,45 μm. Moleculaire gewichtskalibratie van het SEC-kolomscheidingsbereik Kalibreer het scheidingsbereik door een kalibratie van het molecuulgewicht uit te voeren.OPMERKING: In deze studie werden thyroglobuline (660 kDa), Zn/Cu superoxide dismutase (32 kDa), myoglobine (17 kDa) en vitamine B12 (1,36 kDa) gebruikt. Bereid elk van de normen voor met een bekende concentratie in ultrapijn H2O. Bereid een hplc-injectieflacon (high-performance liquid chromatography) voor door 250 μl standaard aan een injectieflacon toe te voegen. Laad de injectieflacons met standaarden op de volgorde van de monsters. Voer de molecuulgewichtkalibratie uit aan het begin en aan het einde van de analytische sequentie en controleer 127I (thyroglobuline), 66Zn (Zn / Cu superoxide dismutase), 57Fe (myoglobine) en 59Co (vitamine B12).OPMERKING: De kalibratie van het molecuulgewicht wordt gelijktijdig uitgevoerd met de Zn-speciatieanalyse. Zinkspeciatie analyse met SEC-ICP-MSOPMERKING: De Zn-soortanalyse volgens de SEC-ICP-MS-methode is ontwikkeld op basis van elders beschreven principes10,11 en verdere optimalisatie is uitgevoerd voor de analyse van een Atlantisch zalmvoer7. Voer de Zn-speciatieanalyse uit op de oplosbare fracties met behulp van een kolom met grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en een HPLC in combinatie met inductief gekoppelde plasmamassaspectroscopie (ICP-MS). Bereid een HPLC-injectieflacon door 250 μL oplosbare fractie aan een injectieflacon toe te voegen. Voor de analyse, spike alle monsters met 0,5 μL vitamine B12. Deze stap maakt het mogelijk om te corrigeren voor retentietijden verschuivingen, monitoring 59Co. Verdun de oplosbare fractie met extractiebuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,5) en pas aan tot een eindvolume van 1 ml. Bereid de volgorde van de monsters in willekeurige volgorde voor. Stem de ICP-MS af volgens de instructies van de fabrikant. Volg de instrumentinstellingen voor de HPLC en ICP-MS die de Zn-speciatieanalyse uitvoeren (zie tabel 1). 2. In vitro oplosbaarheid van aangevuld Zn in Atlantisch zalmvoer OPMERKING: Het gebruikte voedermonster is geformuleerd op basis van commercieel voer voor Atlantische zalm, dat eiwitbronnen bevat die voornamelijk afkomstig zijn van plantaardige ingrediënten (d.w.z. ongeveer 5% vismeel, 10% visolie, 68% plantaardige ingrediënten en 12% plantaardige olie). Maal de Atlantische zalmvoermonsters gedurende 10 s bij 3000 tpm met behulp van een messenmolen en bewaar bij 4 °C tot verdere analyse. Weeg ~0,2 g van de in stap 2.1 gemalen voedingsmonsters en voeg Zn radiotracer(65Zn) van bekende specifieke activiteit toe in een monsterbuis met een volume van 5 ml (met een dop).LET OP: Deze procedure moet worden uitgevoerd in een radionuclidesuite. De persoon die deze stap uitvoert, moet worden getraind en gecertificeerd om radio-isotopen te verwerken. De veiligheids- en voorzorgsmaatregelen die door de stralingsveiligheidsadministratie van het instituut worden geadviseerd, moeten strikt worden gevolgd. Bereid vervolgens de zoetwater intestinale luminale bufferoplossing zoals hieronder beschreven. Weeg voor zoutoplossing A 11,65 g NaNO3,0,55 g KNO3 en 0,4 g MgSO4af. Los de zouten op in ultrapaat H2O en pas aan tot een eindvolume van 60 ml. Weeg voor zoutoplossing B 0,31 g Ca(NO3)2· 4 H2O. Los de zouten op in ultrapaat H2O en stel het in op een eindvolume van 10 ml. Gebruik 500 mM HEPES stockoplossing als zoutoplossing C. Weeg voor zoutoplossing D 1,2 g MgCl2af, los het zout op in ultrapure H2O en pas het aan tot een eindvolume van 20 ml. Voor zoutoplossing E weegt u 0,9 g MgSO4,lost u het zout op in ultrapruim h2O en past u het aan tot een eindvolume van 20 ml. Bereid pyruvaatoplossing door 0,55 g CH3COCOONa op te lossen in 10 ml ultrapaat H2O. Los 0,9 g galactose (C6H12O6) op in ultrapeur H2O. Los goed op met behulp van een magneetroerder en steriliseer zoutoplossingen A, B, D en E door autoclaveren, en oplossing C, pyruvaat en galactose door filtratie door een spuitfilter van 200 μm. Na bereiding van de verschillende stamoplossingen, om 100 ml werkoplossing van de buffer te bereiden, mengt u de bovengenoemde bereide oplossingen in de volgende verhouding: 6,8 ml zoutoplossing A, 4,14 ml B, 5 ml C, 2,5 ml D, 1,5 ml E en 1,14 ml pyruvaat en galactose. Maak het volume aan tot 100 ml met gedeioniseerd water.OPMERKING: De bovenstaande buffer vertegenwoordigt nu de ionische samenstelling van het darmlumen dat wordt aangetroffen in zoetwaterzalmen. Bereid zes andere aliquots van de buffer beschreven in stap 2.6 en voeg een van de volgende aminozuren (cysteïne, methionine, glycine, histidine, lysine en arginine) toe om een uiteindelijke molaire concentratie van 5 mM te bereiken. Voeg de luminale buffer van de zoetwateringinlaat (reactievolume = 3 ml; pH 7,4) toe aan het voedingsmonster. Herhaal stap 2.5 met de in 2.4 beschreven buffers (in aanwezigheid van verschillende aminozuren bij een concentratie van 5 mM). Sluit de buizen en laat ze 30 minuten bij 25 tpm in een roterende spinner draaien. Scheid de oplosbare en niet-oplosbare fracties door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 1157 x g. Gebruik een gammateller om de tellingen per minuut (cpm) van 65 Znin de oplosbare en niet-oplosbare fracties te meten. Bereken het aandeel van de radio-isotopen van Zn (65Zn) aanwezig in de oplosbare en niet-oplosbare fracties. 3. Evaluatie van de opname van chemische Zn-soorten met behulp van een in vitro darmmodel (RTgutGC) RTgutGC-cellenkweekOPMERKING: Alle werkmaterialen die in deze stap worden gebruikt, moeten steriel zijn. Laat de bevroren RTgutGC-cellen voorzichtig herleven in een waterbad op 20 °C. Pipetteer voorzichtig de oplossing die de cellen bevat en suspenseer ze in 10 ml L15-medium met 10% foetaal runderserum (FBS).OPMERKING: 10% FBS wordt alleen gebruikt voor het doen herleven van de bevroren cellen. Voor de volgende passage wordt FBS gebruikt bij 5%. De samenstelling van FBS kan variëren tussen batches, dus het is raadzaam om zoveel te kopen en op voorraad te hebben als nodig is van een enkele batch om inter-batch variaties in de serumsamenstelling te voorkomen. Voeg de celsuspensie toe aan 75 cm2 celkweekkolven en incubeer in een incubator bij 19 °C onder normale atmosfeer. Controleer de cellen en wanneer confluent (80% confluentie, visueel beoordelen door de dichtheid van het celoppervlak onder een microscoop te onderzoeken), splits de cellen in nieuwe kolven (daaropvolgende passage) of oogst om te gebruiken in experimenten.OPMERKING: Een voorbeeld van de RTgutGC-cellen 1 uur en 1 week na het zaaien in de celkweekkolven is weergegeven in figuur 3. Celoogst en voorbereiding op blootstellingsexperimenten Was de cellen tweemaal met 1 ml ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)-oplossing. Na elke wasbeurt hevelt u de EDTA-oplossing uit met behulp van een steriele zuigbuis. Behandel de cellen met trypsine (0,7 ml trypsine, in 0,25% in fosfaat-gebufferde zoutoplossing [PBS]). Draai de kolf voorzichtig onder scherpe hoeken om de trypsine over het oppervlak van de kolf te verspreiden. Blijf 2 minuten draaien, terwijl de cellen loskomen. Voeg na een voorzichtige draaiing gedurende 2 minuten 10 ml L15/FBS-medium toe om trypsine te neutraliseren. Decanteer de resulterende celsuspensie in een conische bodemcentrifugebuis met behulp van een steriele pipet en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 130 x g. Bepaal de dichtheid van de geoogste cellen door handmatig te tellen met behulp van hemocytometer. Voeg het vereiste volume L15/FBS-medium toe om een celdichtheid van 5 x 104 cellen/ml te bereiken. Zaai de cellen op 24-well platen door 1 ml celsuspensie per put te pipetteren om de uiteindelijke celdichtheid van 5 x 104 cellen / put te bereiken.OPMERKING: Gebruik bij voorkeur pipetten met meerdere doseerdoseringen om variatie te minimaliseren en de tijd te verkorten. Plaats de gezaaide platen in een incubator onder normale atmosfeer bij 19 °C gedurende 48 uur voorafgaand aan de experimenten.OPMERKING: Trypsine te bewaar bij -20 °C; EDTA-oplossing en L15/FBS-media bij 4 °C. Stel de temperatuur van alle werkoplossingen en media vlak voor gebruik in op 19 °C. Voorbereiding van blootstellingsmedia OPMERKING: Deze stap moet onder de zuurkast worden uitgevoerd onder aseptische en steriele omstandigheden. Bereid L15/ex door 6,8 ml zoutoplossing A (stap 2.3.1), 1,14 ml B (stap 2.3.2), 5 ml C (stap 2.3.3) en 1,14 ml pyruvaat (stap 2.3.6) en galactose (stap 2.3.7) te mengen. Maak het volume aan tot 100 ml met gedestilleerd water van steriele celkweekkwaliteit. Bereid FW door 6,8 ml zoutoplossing A (2.3.1), 4,14 ml B (2.3.2), 5 ml C (2.3.3), 2,5 ml D (2.3.4), 1,5 ml E (2.3.5) en 1,14 ml pyruvaat (2.3.6) en galactose (2.3.7) te mengen. Maak het volume aan tot 100 ml met steriel gedestilleerd water van celkweekkwaliteit. Kwantificeer de concentraties van ionen in de blootstellingsmedia met behulp van ICP-MS zoals elders beschreven12.OPMERKING: Ionische concentraties geanalyseerd in de mediapreparaten zijn weergegeven in tabel 2. Zink (65Zn) instroom assays Zaai de RTgutGC-cellen op 24-well platen (5 x 104 cellen/put) in volledig L15/FBS medium. Incubeer gedurende 48 uur in een incubator met een normale atmosfeer bij 19 °C. Pas alle experimentele mediapreparaten aan op pH 7,4 met behulp van 0,5 M NaOH in de aan- of afwezigheid van L-methionine (L-Met) of DL-methionine (DL-Met) bij een concentratie van 2 mM.OPMERKING: De pH-aanpassing van de in punt 3.4.3 beschreven buffers moet opnieuw worden uitgevoerd voordat de cellen in stap 3.4.5 worden behandeld. Verwijder na het voltooien van de incubatietijd het medium uit de putten en spoel grondig met PBS. Voeg de pH-aangepaste FW experimentele media toe en laat 20 minuten acclimatiseren. Stel de RTgutGC-cellen bloot aan nominale concentraties van 3,07, 6,14, 12,27 en 24,55 μM 65Zn(II) (als ZnCl2; ~4 kBq/ml) in de in stap 3.4.3 beschreven media. Houd de cellen onmiddellijk daarna gedurende 15 minuten in de couveuse bij 19 °C. Nadat de incubatie van 15 minuten voorbij is, aspirateer je het cultuursupernatant en verwijder je het uit de put. Spoel de cellen met ijskoud FW-medium (met 200 μM Zn, pH 7,4) en blus vervolgens door de buffer van 5 mM ethyleenglycol-bis (β-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraazijnzuur (EGTA) (pH 7,4) gedurende 5 minuten toe te voegen om zich te ontdoen van geadsorbeerde 65Zn(II). Stel de cellen bloot aan de bovenstaande mediapreparaten in de aan- of afwezigheid van 10 mM 2-Aminobicyclo [2.2.1] heptaan-2-carbonzuur (BCH), een aminozuurtransportremmer. Herhaal na de blootstellingsperiode van 15 minuten stap 3.4.8 en 3.4.9. De RtgutGC-cellen worden als monolaag aan de onderkant van de putten gehecht. Verteer de cellen met behulp van 0,2% heet natriumdodecylsulfaat (SDS) reinigingsmiddel (100 μL / put).OPMERKING: De SDS-oplossing moet vóór gebruik gedurende 1 uur in een waterbad van 90 °C worden geplaatst. Adem het cel digestaat op en herstel het in een buis van 1,5 ml. Meet de radioactiviteit van de celverteert met behulp van een gammateller.OPMERKING: De tellingen per minuut (cpm) moeten worden gecorrigeerd voor radioactief verval, achtergrondactiviteit en worden onderworpen aan specifieke activiteitsberekeningen volgens de formules beschreven door Glover en Hogstrand13. Om de eiwitconcentratie van de cellen te kwantificeren, homogeniseert u de cellen met 500 μL van 0,5 M NaOH. Gebruik een Bradford-testkit om de eiwitconcentratie in het celmonster te meten, met runderserumalbumine (BSA) als standaard.OPMERKING: Zodra de eiwitconcentratie is gekwantificeerd, kan de snelheid van Zn-opname door RTgutGC-cellen worden uitgedrukt als pmolen Zn min-1 mg-1 eiwit. 4. Schijnbare beschikbaarheid van dieet Zn in Atlantische zalm (Salmo salar) OPMERKING: De Atlantische zalmvoeders zijn geformuleerd op basis van commerciële voeders, die eiwitbronnen bevatten die voornamelijk afkomstig zijn van plantaardige ingrediënten (d.w.z. ongeveer 5% viseiwit, 10% visolie, 68% plantaardig eiwit en 12% plantaardige olie). Twee voeders werden aangevuld met een anorganische bron (Zn-sulfaat) of een organische bron (Zn-chelaat van glycine) om een Zn-concentratie van 150 mg/kg voer te bereiken. Bovendien werd Yttriumoxide (feed grade) met 0,01% aan het voer toegevoegd als inerte marker om de schijnbare beschikbaarheidscoëfficiënt te kunnen berekenen. Acclimatiseer de Atlantische zalm (SalmoBreed-stam, leeftijd 1 + jaar, groepen van gemengd geslacht) in hun respectieve tanks totdat de vissen gewend zijn aan de experimentele omstandigheden. Beoordeel de acclimatisatie van de Atlantische zalm door hun dagelijkse voeropname te controleren.OPMERKING: Deze proef werd uitgevoerd in drievoudstanks, dus in totaal werden zes tanks gebruikt. Tijdens de voedingsproef was de watertemperatuur 11,9 ± 0,3 °C en de verzadiging van opgeloste zuurstof 101 ± 5%. Voer de vis gedurende 11 dagen met experimentele feeds. Euthanaseer de vis door overdosis met behulp van 6 ml tricaine methaansulfaat stamoplossing per liter water. Verzamel een gepoold monster van uitwerpselen van de vis uit dezelfde tank in een plaat door striping van de ventrale vin naar de anus. Verwijder de uitwerpselen van de plaat met een spatel in een conische buis van 50 ml en bewaar de monsters onmiddellijk bij -20 °C.OPMERKING: De monsters werden bij -20 °C bewaard tot verdere analyse. Vries de uitwerpselenmonsters gedurende 72 uur bij -80 °C. Homogeniseer het ontlastingsmonster handmatig tot een fijn poeder met behulp van een stamper en mortel. Bepaal de concentratie van Zn en Yttrium in de voeder- en ontlastingsmonsters met behulp van een ICP-MS (zoals elders beschreven9). Bepaal de schijnbare beschikbaarheidscoëfficiënt (AAC, %) met behulp van de volgende formule: