تسجيل بصري ذو صورة واحدة في شرائح الدماغ باستخدام صبغ حساس للجهد الكهربائي
Summary
نحن نقدم طريقة تسجيل بصري قابل للتكرار ومستقرة لشرائح الدماغ باستخدام صبغة حساسة للجهد. تصف المقالة تلطيخ الصبغة الحساسة للجهد الكهربائي وتسجيل الإشارات البصرية باستخدام الاستعدادات التقليدية لشريحة الحصين.
Abstract
واسعة المجال واحد الفوتون الجهد الحساسة صبغ (VSD) التصوير من الاستعدادات شريحة الدماغ هو أداة مفيدة لتقييم الاتصال الوظيفي في الدوائر العصبية. بسبب التغير الجزئي في إشارة الضوء، كان من الصعب استخدام هذه الطريقة كتحليل كمي. توضح هذه المقالة البصريات الخاصة وأنظمة معالجة الشرائح، مما يجعل هذه التقنية مستقرة وموثوق بها. توضح هذه المقالة التعامل مع شريحة، تلطيخ، وتسجيل شرائح الحصين الملطخة VSD بالتفصيل. يحافظ النظام على الظروف الفسيولوجية لفترة طويلة، مع تلطيخ جيد، ويمنع الحركات الميكانيكية للشريحة أثناء التسجيلات. وعلاوة على ذلك، فإنه يتيح تلطيخ شرائح مع كمية صغيرة من الصبغة. تحقق البصريات فتحة رقمية عالية عند التكبير المنخفض، مما يسمح بتسجيل إشارة VSD بمعدل إطار أقصى قدره 10 كيلو هرتز، مع دقة مكانية 100 بكسل × 100 بكسل. ونظرا لارتفاع معدل الإطار والدقة المكانية، تسمح هذه التقنية بتطبيق مرشحات ما بعد التسجيل التي توفر نسبة كافية من الإشارة إلى الضوضاء لتقييم التغيرات في الدوائر العصبية.
Introduction
وقد أصبح واسعة المجال واحد الفوتون الحساسة للفولطية الحساسة (VSD) التصوير من الاستعدادات شريحة الدماغ الملطخة بالجملة أداة كمية مفيدة لتقييم ديناميات الدوائر العصبية1،2،3،4 . بعد تحليل التغيرات في الخصائص البصرية بسبب الإثارة الغشاء5,6,7, تم وصف التصوير VSD لأول مرة في أوائل 1970s من قبل كوهين وآخرون6,8, 9. وهو طريقة مناسبة لمراقبة وظائف الدماغ في الوقت الحقيقي كما الصبغة تحقيقات مباشرة التغيرات المحتملة غشاء (أي، إشارة أساسية من الخلايا العصبية).
يمتلك أقرب VSDs الخصائص المرغوبة لفهم نظام الدماغ، مثل سريع الوقت ثابت لمتابعة الحركية السريعة للأحداث المحتملة غشاء الخلايا العصبية، والخطي مع التغير في الغشاء المحتملة9، 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. على غرار تجارب التصوير الأخرى، تتطلب هذه التقنية مجموعة واسعة من التوليفات المحددة، مثل الكاميرات والبصريات والبرمجيات وعلم وظائف الأعضاء، لتحقيق النتائج المرجوة. وبسبب هذه المزالق التقنية، لم تتحقق بالضرورة الفوائد المتوقعة خلال الجهود الأولية بالنسبة لمعظم المختبرات التي لم تكن متخصصة في هذه التقنية.
كان السبب الأولية للصعوبة التقنية ضعف حساسية VSD تجاه التغير المحتمل للغشاء عند تطبيقه على تلطيخ الجزء الأكبر من الاستعدادات شريحة. حجم الإشارة البصرية (أي التغير الكسري في الفلورية) عادة مايكون 10-4 -10-3 من إشارة التحكم (F0) تحت الظروف الفسيولوجية. المقياس الزمني للتغير المحتمل في الغشاء في الخلايا العصبية هو ما يقرب من ميلي ثانية إلى بضع مئات من مللي ثانية. لقياس التغيرات في التغيرات في الغشاء المحتمل للخلايا العصبية، يجب أن تكون الكاميرا المستخدمة للتسجيل قادرة على الحصول على صور بسرعة عالية (10 كيلو هرتز إلى 100 هرتز). تتطلب الحساسية المنخفضة لـ VSD والسرعة اللازمة لمتابعة الإشارة العصبية كمية كبيرة من الضوء ليتم جمعها في الكاميرا بسرعة عالية، مع نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية (S/N)2،16.
كما أن بصريات نظام التسجيل عنصر حاسم لضمان جمع الضوء الكافي وتحسين S/N. التكبير الذي تحققه البصريات غالبا ما يكون منخفضا بشكل مفرط، مثل 1X إلى 10X، لتصور الدائرة العصبية الوظيفية المحلية. على سبيل المثال، لتصور ديناميات الدائرة الحصين، فإن التكبير من حوالي 5 سيكون مناسبا. مثل هذا التكبير منخفضة منخفضة الكفاءة الفلورسنت; لذلك، فإن البصريات المتقدمة تكون مفيدة لمثل هذا التسجيل.
وبالإضافة إلى ذلك، فإن الفسيولوجيا شريحة ضرورية أيضا. وبما أن تحليل التصوير يتطلب أن تكون الشرائح سليمة، فإن هناك حاجة إلى التعامل مع شريحة دقيقة17. وعلاوة على ذلك، فإن التدابير المتخذة للحفاظ على صلاحية الشريحة لفترة أطول هي18.
تصف هذه المقالة بروتوكول إعداد الشرائح، تلطيخ VSD، والقياسات. كما توضح المقالة التحسينات التي أدخلت على VSDs وجهاز التصوير والبصريات، وغيرها من التحسينات الإضافية للنظام التجريبي التي مكنت من استخدام هذه الطريقة كاختبار مباشر وقوي وكمي لتصور تعديل وظائف الدماغ19,20,21,22,23,24,25. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية على نطاق واسع للتقوية على المدى الطويل في منطقة CA1 من شرائح الحصين1. وعلاوة على ذلك، هذه التقنية هي أيضا مفيدة في التسجيل البصري لإمكانات الغشاء في خلية عصبية واحدة26.
Protocol
Representative Results
Discussion
الفسيولوجيا شريحة أمر حيوي لجمع الإشارة الصحيحة. استخدام نظام تصفية غشاء حلقة في هذا البروتوكول يضمن أن شريحة لا تزال صحية وغير مشوهة في جميع أنحاء الإجراء2,16,17. يمكن استخدام أنظمة أخرى للاحتفاظ بشريحة وظائف الأعضاء أثناء التسجيل، ولكن ي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تلقت TT منحة KAKENHI JSPS (JP16H06532، JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038, و JP15K00413) من MEXT والمنح من وزارة الصحة والعمل والرعاية الاجتماعية (MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] وH30 [18062156]). نود أن نشكر Editage (www.editage.jp) على تحرير اللغة الإنجليزية.
Materials
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM – Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/ 0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
References
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation. Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).
- Homma, R., et al. Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).
- Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity. Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).
- Hill, D., Keynes, R. Opacity changes in stimulated nerve. The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).
- Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential. Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).
- Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System. Nature. 246 (5434), (1973).
- Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. Optical Methods for Monitoring Neuron Activity. Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. A large change in dye absorption during the action potential. Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).
- Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon. Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).
- Loew, L. M., et al. A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations. The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).
- Mullah, S., et al. Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System. The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).
- Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus. Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).
- Tominaga, T., Ichikawa, M. Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. , (2002).
- Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).
- Tanemura, K., et al. Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau. Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).
- Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation. Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).
- Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
- Juliandi, B., et al. Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid. Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).
- Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).
- Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Sakmann, B., Stuart, G. . Single-Channel Recording. , (1995).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices. Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).
- Mennerick, S., et al. Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function. The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).
- Canitano, R., Pallagrosi, M. Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories. Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).
- Anticevic, A., Murray, J. D. Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum. Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).
- Busche, M., Konnerth, A. Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).
- Knöpfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).
- Knöpfel, T. Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits. Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).
- Tominaga, T., Tominaga, Y. A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity. Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).
