Gerilim duyarlı boya kullanarak beyin dilimleri geniş alan tek foton optik kayıt
Summary
Gerilim duyarlı boya kullanarak beyin dilimleri için tekrarlanabilir ve istikrarlı bir optik kayıt yöntemi sunuyoruz. Bu yazıda konvansiyonel hipokampal dilim preparatları kullanılarak voltaj duyarlı boya boyama ve optik sinyallerin kaydedilmesi açıklanmaktadır.
Abstract
Beyin dilim preparatlarının geniş alan tek foton voltajı duyarlı boya (VSD) görüntülenmesi, nöral devrelerde fonksiyonel bağlantı değerlendirmek için yararlı bir araçtır. Işık sinyalinde fraksiyonel değişiklik nedeniyle, bu yöntemi bir nicel tahlil olarak kullanmak zor olmuştur. Bu makalede, özel optik ve dilim işleme sistemleri, bu tekniği istikrarlı ve güvenilir hale açıklar. Bu makalede, dilim işleme, boyama ve VSD lekeli hipokampal dilimleri ayrıntılı olarak kaydedilmesini gösterir. Sistem uzun süre fizyolojik koşulları korur, iyi boyama ile, ve kayıtlar sırasında dilim mekanik hareketlerini önler. Dahası, küçük bir miktar boya ile dilimlerin boyama sağlar. Optik, 100 piksel x 100-piksel uzamsal çözünürlüğe sahip, 10 kHz maksimum kare hızında VSD sinyalinin kaydedilmesine olanak sağlayan düşük büyütmede yüksek sayısal diyaframı elde edilir. Yüksek kare hızı ve uzamsal çözünürlüğe bağlı olarak, bu teknik, nöral devrelerdeki değişiklikleri değerlendirmek için yeterli sinyal-gürültü oranı sağlayan kayıt sonrası filtrelerin uygulanması sağlar.
Introduction
Geniş alan tek foton voltaj duyarlı boya (VSD) toplu lekeli beyin dilim preparatları görüntüleme nöral devrelerin dinamiklerini değerlendirmek için yararlı bir nicel aracı haline gelmiştir1,2,3,4 . Membran uyarma5,6,7, VSD görüntüleme nedeniyle optik özelliklerdeki değişikliklerin analizinden sonra ilk olarak 1970 ‘ lerin başında Cohen ve diğerleri tarafından tanımlanmıştır6,8, 9.; boya doğrudan membran potansiyel değişiklikler (yani, nöronların birincil sinyali) problar gibi gerçek zamanlı olarak beyin fonksiyonlarını izlemek için uygun bir yöntemdir.
İlk VSDs beyin sistemi anlamak için arzu edilen özelliklere sahip, gibi hızlı bir zaman sabit nöronal membran potansiyel olayların hızlı kinetiği takip etmek, ve membran potansiyelinin değişikliği ile doğrusallık9, 10 ‘ dan fazla , 11 ‘ i , 12 tane , 13 ‘ ü , 14 , 15. diğer görüntüleme deneylerine benzer şekilde, bu teknik, istenilen sonuçları başarmak için kameralar, optik, yazılım ve dilim fizyolojisi gibi geniş bir yelpazede özel ayarlamalar gerektirir. Bu teknik tuzaklar nedeniyle, ilk çabaları sırasında beklenen faydaları mutlaka bu teknikte uzmanlaşmadı laboratuvarların çoğu için gerçekleştirmez.
Teknik zorluk ilkel nedeni, dilim preparatlarının toplu boyama uygulandığında membran potansiyel değişim doğru VSD düşük duyarlılığı oldu. Optik sinyal büyüklüğü (yani, floresan fraksiyonel değişim) genellikle 10-4-10-3 kontrol (F0) fizyolojik koşullar altında sinyal. Bir nöron membran potansiyel değişim zaman ölçeği yaklaşık milisaniyeye kadar birkaç milisaniye. Neuron membran potansiyelinin değişikliklerini ölçmek için, kayıt için kullanılan kamera yüksek hızda (10 kHz-100 Hz) görüntüleri elde edebilmek gerekir. VSD ‘nin düşük duyarlılığı ve sinir sinyalini takip etmek için gereken hız, yüksek bir sinyal-gürültü oranı (S/N)2,16ile yüksek hızda fotoğraf makinesinde toplanan büyük miktarda ışık gerektirir.
Kayıt sisteminin optik yeterli ışık toplama ve S/N geliştirmek için de kritik bir unsurdur. Optik tarafından elde edilen büyütme genellikle aşırı düşük, 1X gibi 10X, yerel fonksiyonel nöral devre görselleştirmek için. Örneğin, hipokampal devresinin dinamiklerini görselleştirmek için yaklaşık 5 ‘ in büyütme uygun olacaktır. Bu kadar düşük büyütme düşük floresan verimliliğine sahiptir; Bu nedenle, gelişmiş optik bu tür kayıt için yararlı olacaktır.
Buna ek olarak, dilim fizyolojisi de esastır. Görüntüleme analizi dilimlerin bozulmamış olmasını gerektirdiğinden, dikkatli dilim işleme17gereklidir. Ayrıca, daha uzun bir süre için dilim canlılığı korumak için alınan önlemler önemlidir18.
Bu makalede dilimler, VSD boyama ve ölçümler hazırlanması için protokol açıklanmaktadır. Makale Ayrıca VSDs, görüntüleme aygıtı ve optik geliştirmeleri ve diğer ek geliştirmeler için bu yöntemi etkin bir basit, güçlü ve nicel tahlil olarak kullanılmak üzere etkinleştirmiş deneysel sisteme özetliyor beyin fonksiyonlarının değiştirilmesi19,20,21,22,23,24,25. Tekniği de yaygın hipokampal dilimleri CA1 alanında uzun vadeli potansiyasyon için kullanılabilir1. Dahası, bu teknik aynı zamanda tek bir sinir hücresi26membran potansiyelleri optik kayıt yararlıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dilim fizyolojisi doğru sinyali toplamak için hayati önem taşımaktadır. Bu protokolde halka membran filtre sisteminin kullanımı, dilimin sağlıklı kalmasını ve prosedür2,16,17boyunca bozulmasını sağlar. Diğer sistemler kayıt sırasında dilim fizyolojisini korumak için kullanılabilir, ancak görüntüleme, dilimin her parçası sağlıklı olması için gerektiğinde herhangi bir zamanda deforme olmamalıdır…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TT, MEXT ‘den JSPS KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 ve JP15K00413) ve sağlık, çalışma ve refah Bakanlığından (MHLW-Kagaku-ıppan-H27 [15570760] ve H30 [18062156]) alınan hibe aldı. Biz Ingilizce dil düzenleme için Editage (www.editage.jp) teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM – Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/ 0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
References
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation. Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).
- Homma, R., et al. Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).
- Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity. Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).
- Hill, D., Keynes, R. Opacity changes in stimulated nerve. The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).
- Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential. Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).
- Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System. Nature. 246 (5434), (1973).
- Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. Optical Methods for Monitoring Neuron Activity. Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. A large change in dye absorption during the action potential. Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).
- Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon. Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).
- Loew, L. M., et al. A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations. The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).
- Mullah, S., et al. Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System. The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).
- Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus. Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).
- Tominaga, T., Ichikawa, M. Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. , (2002).
- Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).
- Tanemura, K., et al. Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau. Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).
- Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation. Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).
- Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
- Juliandi, B., et al. Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid. Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).
- Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).
- Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Sakmann, B., Stuart, G. . Single-Channel Recording. , (1995).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices. Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).
- Mennerick, S., et al. Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function. The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).
- Canitano, R., Pallagrosi, M. Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories. Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).
- Anticevic, A., Murray, J. D. Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum. Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).
- Busche, M., Konnerth, A. Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).
- Knöpfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).
- Knöpfel, T. Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits. Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).
- Tominaga, T., Tominaga, Y. A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity. Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).
