Weitfeld-Einzelphotonen optische Aufnahme in Gehirnscheiben mit spannungsempfindlichem Farbstoff

Wide-Field Single Photon Voltage-Sensitive Dye (VSD) Imaging of bulk-stained brain slice preparations has become a useful quantitative tool to assess the dynamics of neural circuits^1,2,3,4 . Nach der Analyse der Veränderungen der optischen Eigenschaften durch Membrananregung^5,6,7wurde DIE VSD-Bildgebung erstmals in den frühen 1970er Jahren von Cohen und anderen^{6,8, 9}. ; es ist eine geeignete Methode, um die Gehirnfunktionen in Echtzeit zu überwachen, da der Farbstoff direkt die Membranpotentialveränderungen (d.h. das primäre Signal der Neuronen) untersucht.

Die frühesten VSDs besaßen die wünschenswerten Eigenschaften, um das Gehirnsystem zu verstehen, wie eine schnelle Zeitkonstante, um die schnelle Kinetik neuronaler Membranpotentialereignisse zu verfolgen, und Linearität mit der Veränderung des Membranpotentials^{9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15}. Ähnlich wie bei anderen bildgebenden Experimenten erfordert diese Technik eine breite Palette spezifischer Abstimmungen, wie Kameras, Optik, Software und Slice-Physiologie, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen. Aufgrund dieser technischen Fallstricke waren die erwarteten Vorteile bei den ersten Bemühungen für die meisten Laboratorien, die sich nicht auf diese Technik spezialisiert hatten, nicht unbedingt eingetreten.

Die Urursache der technischen Schwierigkeit war die geringe Empfindlichkeit des VSD gegenüber der Membranpotenzialänderung, wenn sie auf Diemassenfärbung von Scheibenpräparaten angewendet wurde. Die Größe des optischen Signals (d.h. die fraktionierte Veränderung der Fluoreszenz) beträgt in der Regel 10^-4-10^-3 des Steuersignals (F0) unter physiologischen Bedingungen. Die Zeitskala der Membranpotentialänderung in einem Neuron beträgt ungefähr Millisekunden bis wenige hundert Millisekunden. Um die Veränderungen des Membranpotenzials des Neurons zu messen, sollte die kamera, die für die Aufnahme verwendet wird, in der Lage sein, Bilder mit hoher Geschwindigkeit (10 kHz bis 100 Hz) zu erfassen. Die geringe Empfindlichkeit von VSD und die Geschwindigkeit, die benötigt wird, um dem neuronalen Signal zu folgen, erfordert eine große Menge an Licht, um an der Kamera mit hoher Geschwindigkeit gesammelt zu werden, mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis (S/N)^2,16.

Die Optik des Aufzeichnungssystems ist auch ein entscheidendes Element, um die Erfassung von ausreichend Licht zu gewährleisten und S/N zu verbessern. Die von der Optik erreichte Vergrößerung ist oft zu niedrig, z. B. 1X bis 10X, um einen lokalen funktionellen neuronalen Schaltkreis zu visualisieren. Um beispielsweise die Dynamik des Hippocampus zu visualisieren, wäre eine Vergrößerung von etwa 5 geeignet. Eine solche geringe Vergrößerung hat eine geringe Fluoreszenzeffizienz; daher wäre eine fortschrittliche Optik für eine solche Aufnahme von Vorteil.

Darüber hinaus ist auch die Scheibenphysiologie von wesentlicher Bedeutung. Da die bildgebende Analyse erfordert, dass die Slices intakt sind, ist eine sorgfältige Schnittverarbeitung erforderlich¹⁷. Darüber hinaus sind Maßnahmen, die ergriffen werden, um die Realisierbarkeit der Scheibe für einen längeren Zeitpunkt zu erhalten, wichtig¹⁸.

Der vorliegende Artikel beschreibt das Protokoll zur Vorbereitung von Scheiben, VSD-Färbung und Messungen. Der Artikel beschreibt auch die Verbesserungen der VSDs, des Bildgebungsgeräts und der Optik sowie andere zusätzliche Verfeinerungen des experimentellen Systems, die es ermöglicht haben, diese Methode als einfache, leistungsstarke und quantitative Assay zur Visualisierung der Veränderung der Gehirnfunktionen^{19,20,21,22,23,24,25}. Die Technik kann auch weit verbreitet für langfristige Potenzierung im CA1-Bereich von Hippocampus-Scheiben¹verwendet werden. Darüber hinaus ist diese Technik auch bei der optischen Erfassung von Membranpotentialen in einer einzelnen Nervenzelle²⁶nützlich.