Wide-veld single-foton optische opname in de hersenen schijfjes met behulp van spanning-gevoelige kleurstof
Summary
We introduceren een reproduceerbare en stabiele optische opnamemethode voor hersen schijfjes met spannings gevoelige kleurstof. Het artikel beschrijft spanning-gevoelige kleurstof beitsen en het opnemen van optische signalen met behulp van conventionele hippocampale slice preparaten.
Abstract
Wide-veld single foton voltage-Sensitive Dye (VANHOOF) Imaging van de hersenen slice preparaten is een nuttig instrument om de functionele connectiviteit in neurale circuits te beoordelen. Wegens de verwaarloosbare verandering in het lichtsignaal, is het moeilijk geweest om deze methode als kwantitatieve analyse te gebruiken. Dit artikel beschrijft speciale optica en slice handling systemen, die deze techniek stabiel en betrouwbaar maken. Het huidige artikel toont de slice handling, kleuring, en de opname van de VANHOOF-gekleurd hippocampale plakjes in detail. Het systeem handhaaft lange tijd fysiologische voorwaarden, met het goede bevlekken, en verhindert mechanische bewegingen van het segment tijdens de opnamen. Bovendien maakt het kleuring van plakjes met een kleine hoeveelheid van de kleurstof. De optica bereiken hoge numerieke diafragma bij lage vergroting, die het mogelijk maakt de opname van de VANHOOF signaal op de maximale frame rate van 10 kHz, met 100 pixel x 100-pixel ruimtelijke resolutie. Door de hoge frame rate en ruimtelijke resolutie, deze techniek maakt het mogelijk de toepassing van de post-Recording filters die voldoende signaal-ruisverhouding te bieden aan de veranderingen in de neurale circuits te beoordelen.
Introduction
Wide-veld Single Photon voltage-Sensitive Dye (Vanhoof) beeldvorming van bulk-gekleurde hersenen slice preparaten is uitgegroeid tot een nuttig kwantitatief instrument om de dynamiek van de neurale circuits1,2,3,4 te beoordelen . Na de analyse van de veranderingen in optische eigenschappen toe te schrijven aan membraan opwinding5,6,7, werd de weergave van Vanhoof eerst beschreven in de vroege jaren ‘ 70 door Cohen en anderen6,8, 9.; het is een geschikte methode om de hersenen functies in real-time te controleren als de kleurstof direct sondes het membraan potentiële veranderingen (dat wil zeggen, het primaire signaal van de neuronen).
Vroegste VSDs bezat de wenselijke kenmerken om het hersenen systeem, zoals een snelle tijd-constante te begrijpen om de snelle kinetica van neuronale membraan potentiële gebeurtenissen te volgen, en lineariteit met de verandering in membraan potentieel9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. vergelijkbaar met andere Imaging experimenten, deze techniek vereist een breed scala van specifieke tunings, zoals de camera’s, optica, software, en slice fysiologie, om de gewenste resultaten te bereiken. Vanwege deze technische valkuilen, de verwachte voordelen tijdens de initiële inspanningen niet noodzakelijkerwijs materialiseren voor de meeste van de laboratoria die niet gespecialiseerd in deze techniek.
De oorspronkelijke oorzaak van de technische moeilijkheid was de lage gevoeligheid van de VANHOOF in de richting van het membraan potentiële verandering wanneer toegepast op bulk kleuring van slice preparaten. De grootte van het optische signaal (d.w.z., de verwaarloosbare verandering in fluorescentie) is gewoonlijk 10-4-10-3 van het signaal van de controle (F0) onder fysiologische voorwaarden. De tijdschaal van membraanpotentiaal verandering in een neuron is ongeveer milliseconden tot enkele honderden milliseconden. Voor het meten van de veranderingen in het membraan potentieel van het neuron, de camera wordt gebruikt voor de opname moet in staat zijn om beelden te verwerven met hoge snelheid (10 kHz tot 100 Hz). De lage gevoeligheid van de Vanhoof en de snelheid die nodig is om het neurale signaal te volgen, vereist een grote hoeveelheid licht die bij de camera op hoge snelheid moet worden verzameld, met een hoge signaal-ruisverhouding (S/N)2,16.
De optica van het opnamesysteem is ook een kritisch element om inzameling van voldoende licht te verzekeren en S/N te verbeteren. De vergroting bereikt door de optiek is vaak overdreven laag, zoals 1X tot 10X, om een lokale functionele neurale circuit te visualiseren. Bijvoorbeeld om de dynamiek van het hippocampale circuit te visualiseren, zou een vergroting van ongeveer 5 geschikt zijn. Dergelijke lage vergroting heeft lage fluorescentie efficiency; Daarom zou geavanceerde optiek gunstig zijn voor een dergelijke opname.
Daarnaast is de slice fysiologie is ook van essentieel belang. Aangezien de Imaging-analyse vereist dat de plakjes intact zijn, is zorgvuldige slice handling nodig17. Bovendien zijn maatregelen genomen om de slice levensvatbaarheid voor een langere tijd te handhaven belangrijk18.
Het onderhavige artikel beschrijft het protocol voor de voorbereiding van plakjes, VANHOOF kleuring en metingen. Het artikel schetst ook de verbeteringen aan de VSDs, imaging-apparaat, en optica, en andere extra verfijningen aan de experimentele systeem dat hebben ingeschakeld deze methode te worden gebruikt als een eenvoudige, krachtige en kwantitatieve assay voor het visualiseren van de wijziging van de hersenen functies19,20,21,22,23,24,25. De techniek kan ook op grote schaal worden gebruikt voor lange termijn potentiëring in de CA1 gebied van hippocampale slices1. Bovendien, deze techniek is ook nuttig bij optische opname van membraanpotentiaal in een enkele zenuwcel26.
Protocol
Representative Results
Discussion
De slice fysiologie is van vitaal belang voor het verzamelen van het juiste signaal. Het gebruik van het ring-membraanfilter systeem in dit protocol zorgt ervoor dat het segment gezond en onvervormd blijft gedurende de procedure2,16,17. Andere systemen kunnen worden gebruikt om segment fysiologie te behouden tijdens de opname, maar de slice moet niet vervormd te krijgen op elk moment als de beeldvorming moet elk deel van het seg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TT ontving de JSPS KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038, en JP15K00413) uit MEXT en subsidies van het ministerie van volksgezondheid, arbeid en welzijn (MHLW-Kagaku-Ippan-H27 [15570760] en H30 [18062156]). Wij willen Editage (www.editage.jp) bedanken voor het bewerken van het Engels.
Materials
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM – Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/ 0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
References
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation. Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).
- Homma, R., et al. Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).
- Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity. Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).
- Hill, D., Keynes, R. Opacity changes in stimulated nerve. The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).
- Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential. Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).
- Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System. Nature. 246 (5434), (1973).
- Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. Optical Methods for Monitoring Neuron Activity. Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. A large change in dye absorption during the action potential. Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).
- Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon. Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).
- Loew, L. M., et al. A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations. The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).
- Mullah, S., et al. Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System. The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).
- Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus. Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).
- Tominaga, T., Ichikawa, M. Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. , (2002).
- Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).
- Tanemura, K., et al. Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau. Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).
- Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation. Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).
- Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
- Juliandi, B., et al. Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid. Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).
- Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).
- Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Sakmann, B., Stuart, G. . Single-Channel Recording. , (1995).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices. Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).
- Mennerick, S., et al. Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function. The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).
- Canitano, R., Pallagrosi, M. Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories. Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).
- Anticevic, A., Murray, J. D. Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum. Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).
- Busche, M., Konnerth, A. Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).
- Knöpfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).
- Knöpfel, T. Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits. Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).
- Tominaga, T., Tominaga, Y. A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity. Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).
