電圧感受性染料を用いた脳スライスにおける広視野単一光子光学記録

バルク染色された脳スライス製剤の広視野単一光子電圧感受性色素(VSD)イメージングは、神経回路1、2、3、4のダイナミクスを評価するのに有用な定量的ツールとなっています。.膜励起5、6、7、VSDイメージングによる光学特性の変化の分析の後、コーエンらによって1970年代初頭に最初に説明された6,8、 ⁹. ;染料が膜電位変化(すなわち、ニューロンの一次シグナル)を直接プローブするので、脳の機能をリアルタイムで監視するのに適した方法です。

最も初期のVSDは、神経膜電位事象の急速な運動性に従う速い時間定数、膜電位^の変化との直線性など、脳システムを理解するために望ましい特性を有していた9、^{10歳,11歳,12歳,13歳,14歳,15.}他のイメージング実験と同様に、この技術は、カメラ、光学、ソフトウェア、スライス生理学などの幅広い特定のチューニングを必要とし、所望の結果を達成する必要があります。これらの技術的な落とし穴のために、最初の努力の間に期待される利点は、必ずしもこの技術に特化していない研究室のほとんどのために実現しませんでした。

技術的な困難の主な原因は、スライス製剤のバルク染色に適用した場合の膜電位変化に対するVSDの低感度であった。光信号の大きさ(すなわち、蛍光の分画変化)は、通常、生理的条件下での対照(F0)信号の10-4-10-3である。ニューロンにおける膜電位変化の時間スケールは、約ミリ秒から数百ミリ秒です。ニューロンの膜電位の変化を測定するには、記録に使用されるカメラは、高速(10 kHz~100Hz)で画像を取得できる必要があります。VSDの低感度とニューラル信号に従うために必要な速度は、高い信号対雑音比(S/N)2、16で、高速でカメラに集める大量の光を必要とします。

記録システムの光学はまた十分な光のコレクションを保障し、S/Nを改善するために重要な要素である。光学系によって達成される倍率は、多くの場合、局所的な機能的な神経回路を可視化するために、1Xから10Xなど、過度に低いです。例えば、海馬回路のダイナミクスを可視化するためには、約5倍の倍率が適しているであろう。このような低倍率は、低蛍光効率を有する;したがって、高度な光学系は、このような記録のために有益であろう。

また、スライス生理学も不可欠です。イメージング解析ではスライスをそのままにする必要があるため、慎重なスライス処理が必要です¹⁷.さらに、スライスの生存率を長期間維持するための対策が重要^である18.

本稿では、スライスの調製、VSD染色、および測定のためのプロトコルについて説明する。また、VSD、イメージングデバイス、光学系の改善、および実験システムに対するその他の改良点の概要を説明し、この方法を視覚化するための簡単で強力で定量的なアッセイとして使用することを可能にしました。脳機能の修飾^{19,20,21,22,23,24,25}.この技術はまた、海馬^{スライス1}のCA1領域における長期増強のために広く使用することができる。さらに、この技術は、単一の神経^細胞26における膜電位の光学的記録にも有用である。