Grabación óptica de campo ancho de un solo fotón en cortes cerebrales con tinte sensible al voltaje
Summary
Introducimos un método de grabación óptica reproducible y estable para las rebanadas cerebrales utilizando tinte sensible al voltaje. El artículo describe la tinción de tinte sensible al voltaje y el registro de señales ópticas utilizando preparaciones convencionales de corte de hipocampo.
Abstract
La imagen de tinte sensible al voltaje de fotón (VSD) de campo ancho de las preparaciones de corte cerebral es una herramienta útil para evaluar la conectividad funcional en circuitos neuronales. Debido al cambio fraccionario en la señal de luz, ha sido difícil utilizar este método como un ensayo cuantitativo. En este artículo se describen los sistemas especiales de manipulación de equipos ópticos y de corte, que hacen que esta técnica sea estable y confiable. El presente artículo muestra en detalle el manejo de las rebanadas, la tinción y el registro de las rebanadas de hipocampo teñidas con VSD. El sistema mantiene las condiciones fisiológicas durante mucho tiempo, con buena tinción, y evita los movimientos mecánicos de la rebanada durante las grabaciones. Además, permite la tinción de rodajas con una pequeña cantidad del tinte. La óptica logra una alta apertura numérica con bajo aumento, lo que permite la grabación de la señal VSD a la velocidad de fotogramas máxima de 10 kHz, con resolución espacial de 100 píxeles x 100 píxeles. Debido a la alta velocidad de fotogramas y la resolución espacial, esta técnica permite la aplicación de los filtros posteriores a la grabación que proporcionan una relación señal-ruido suficiente para evaluar los cambios en los circuitos neuronales.
Introduction
La imagen de tinte sensible al voltaje de fotones de campo ancho (VSD) de preparaciones de rebanadas cerebrales teñidas a granel se ha convertido en una herramienta cuantitativa útil para evaluar la dinámica de los circuitos neuronales1,2,3,4 . Después del análisis de los cambios en las propiedades ópticas debido a la excitación de la membrana5,6,7, imágenes VSD fue descrito por primera vez a principios de la década de 1970 por Cohen y otros6,8, 9. ; es un método adecuado para monitorear las funciones cerebrales en tiempo real, ya que el tinte sondea directamente los cambios potenciales de la membrana (es decir, la señal primaria de las neuronas).
Los primeros VSD poseían las características deseables para entender el sistema cerebral, como una rápida constante en el tiempo para seguir la rápida cinética de los eventos potenciales de la membrana neuronal, y la linealidad con el cambio en el potencial de membrana9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. Al igual que otros experimentos de imágenes, esta técnica requiere una amplia gama de ajustes específicos, como las cámaras, óptica, software y fisiología de la rebanada, para lograr los resultados deseados. Debido a estos escollos técnicos, los beneficios esperados durante los esfuerzos iniciales no necesariamente se materializaron para la mayoría de los laboratorios que no se especializaron en esta técnica.
La causa primaria de la dificultad técnica fue la baja sensibilidad del VSD hacia el cambio potencial de membrana cuando se aplica a la tinción a granel de preparaciones de rodajas. La magnitud de la señal óptica (es decir, el cambio fraccionario en fluorescencia) es generalmente 10-4-10-3 de la señal de control (F0) en condiciones fisiológicas. La escala de tiempo del cambio potencial de membrana en una neurona es de aproximadamente milisegundos a pocos cientos de milisegundos. Para medir los cambios en el potencial de membrana de la neurona, la cámara que se utiliza para la grabación debe ser capaz de adquirir imágenes a alta velocidad (10 kHz a 100 Hz). La baja sensibilidad de VSD y la velocidad necesaria para seguir la señal neuronal requiere una gran cantidad de luz para ser recogido en la cámara a alta velocidad, con una alta relación señal-ruido (S/N)2,16.
La óptica del sistema de grabación también es un elemento crítico para garantizar la recopilación de luz suficiente y para mejorar S/N. El aumento logrado por la óptica es a menudo excesivamente bajo, como 1X a 10X, para visualizar un circuito neural funcional local. Por ejemplo, para visualizar la dinámica del circuito hipocampal, un aumento de aproximadamente 5 sería adecuado. Dicho bajo aumento tiene baja eficiencia de fluorescencia; por lo tanto, la óptica avanzada sería beneficiosa para dicha grabación.
Además, la fisiología de las rebanadas también es esencial. Dado que el análisis de imágenes requiere que los sectores estén intactos, se necesita un manejo cuidadoso de las rebanadas17. Además, las medidas adoptadas para mantener la viabilidad de las rebanadas durante más tiempo son importantes18.
En el presente artículo se describe el protocolo para la preparación de rodajas, tinción VSD y mediciones. El artículo también describe las mejoras en los VSD, el dispositivo de imagen y la óptica, y otros refinamientos adicionales al sistema experimental que han permitido que este método se utilice como un ensayo sencillo, potente y cuantitativo para visualizar el modificación de las funciones cerebrales19,20,21,22,23,24,25. La técnica también puede ser ampliamente utilizada para la potenciación a largo plazo en el área CA1 de las rodajas de hipocampo1. Además, esta técnica también es útil en la grabación óptica de potenciales de membrana en una sola célula nerviosa26.
Protocol
Representative Results
Discussion
La fisiología de la rebanada es vital para recoger la señal correcta. El uso del sistema de filtro de anillo-membrana en este protocolo garantiza quela rebanada permanezca sana y sin distorsión durante todo el procedimiento 2,16,17. Otros sistemas se pueden utilizar para retener la fisiología de las rebanadas durante la grabación, pero la rebanada no debe deformarse en ningún momento, ya que la imagen necesita que cada par…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TT recibió la Beca JSPS KAKENHI (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 y JP15K00413) de MEXT y subvenciones del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar (MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] y H30 [18062156]). Nos gustaría agradecer a Editage (www.editage.jp) por la edición en inglés.
Materials
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM – Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/ 0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
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