הקלטה אופטית חד-שלמה של פוטון בפרוסות מוח באמצעות שימוש במתח-צבע רגיש
Summary
אנו מציגים שיטת הקלטה אופטית ויציבה לפרוסות מוח באמצעות צבע רגיש למתח. המאמר מתאר מכתים צבע רגיש מתח והקלטה של אותות אופטיים באמצעות הכנה היפוקמאל הפרוסות המקובלת.
Abstract
שטח רחב בודד פוטון בודדת צבע רגיש (VSD) הדמיה של ההכנות פרוסת המוח הוא כלי שימושי כדי להעריך את הקישוריות תפקודית במעגלים עצביים. עקב שינוי השבר באות האור, היה קשה להשתמש בשיטה זו כתוך שיטה כמותית. מאמר זה מתאר מערכות מיוחדות לטיפול באופטיקה ופרוסות, המתארות טכניקה זו ליציבה ולאמינות. המאמר הנוכחי ממחיש את הטיפול פרוסה, כתמים, והקלטה של פרוסות VSD מוכתם היפוקמאל בפירוט. המערכת שומרת על התנאים הפיזיולוגיים זמן רב, עם כתמים טובים, ומונעת תנועות מכניות של הפרוסה במהלך ההקלטות. כמו-כן, היא מאפשרת צביעת פרוסות בכמות קטנה של הצבע. האופטיקה להשיג צמצם מספרי גבוה בהגדלה נמוכה, אשר מאפשר הקלטה של האות VSD בקצב מסגרת מקסימלית של 10 kHz, עם 100 פיקסל x 100 פיקסל מרחבי רזולוציה. בשל קצב הפריימים הגבוה והרזולוציה המרחבית, טכניקה זו מאפשרת יישום של המסננים שלאחר ההקלטה, המספקים יחס מספיק של אות לרעש כדי להעריך את השינויים במעגלים העצביים.
Introduction
הדמיה של המוח הרחב במיוחד פוטון בודד צבע רגיש (vsd) דימות של מוכתם בצובר מוחית ההכנות לנתח הפך כלי כמותי שימושי כדי להעריך את הדינמיקה של מעגלים עצביים1,2,3,4 . לאחר ניתוח של שינויים במאפיינים אופטיים בשל עירור ממברנה5,6,7, הדמיה vsd תוארה לראשונה בשנות ה-70 המוקדמות על ידי כהן ואחרים6,8, 9.; זוהי שיטה מתאימה לפקח על פונקציות המוח בזמן אמת כמו הצבע ישירות בדיקה שינויים פוטנציאליים הממברנה (כלומר, האות העיקרי של הנוירונים).
VSDs המוקדמים ביותר היו המאפיינים הרצוי כדי להבין את מערכת המוח, כגון מהיר בזמן קבוע לעקוב אחר קינטיקה מהירה של אירועים פוטנציאליים קרום עצבי, ו יניאריות עם השינוי בקרום פוטנציאל9, מיכל עשור , מיכל בן 11 , מיכל בן 12 , מיכל בן 13 , מיכל בן 14 , 15. דומה לניסויים אחרים בדימות, טכניקה זו דורשת מגוון רחב של מינהור מסוים, כגון המצלמות, האופטיקה, התוכנה והפיזיולוגיה של הפרוסה, כדי להשיג את התוצאות הרצויות. בשל מלכודות טכניות אלה, היתרונות הצפויים במהלך המאמצים הראשוניים לא בהכרח התמחו עבור רוב המעבדות שלא המתמחות בטכניקה זו.
הגורם הראשוני של הקושי הטכני היה רגישות נמוכה של VSD לקראת שינוי פוטנציאלי הממברנה כאשר מיושם כתמים בצובר של ההכנות פרוסה. גודל האות האופטי (כלומר, השינוי החלקי בקרינה הפלואורסצנטית) הוא בדרך כלל 10-4-10-3 של השלט (F0) אות בתנאים פיזיולוגיים. סולם הזמן של שינוי פוטנציאלי של קרום בעצב הוא כ אלפיות שניה עד כמה מאות אלפיות שניה. כדי למדוד את השינויים בפוטנציאל הממברנה של העצב, המצלמה בשימוש עבור ההקלטה צריך להיות מסוגל להשיג תמונות עם מהירות גבוהה (10 kHz כדי 100 Hz). רגישות נמוכה של vsd ואת המהירות הדרושה כדי לעקוב אחר האות העצבית דורש כמות גדולה של אור לאסוף במצלמה במהירות גבוהה, עם יחס אות לרעש גבוה (S/N)2,16.
האופטיקה של מערכת ההקלטה הם גם אלמנט קריטי כדי להבטיח איסוף של אור מספיק כדי לשפר את S/N. ההגדלה שהושגה על-ידי האופטיקה היא לעתים קרובות נמוכה באופן מוגזם, כגון 1X כדי 10X, כדי להמחיש מעגל עצבי מקומי פונקציונלי. לדוגמה, כדי להמחיש את הדינמיקה של מעגל ההיפוקמאל, הגדלה של כ -5 תהיה מתאימה. להגדלה כזו נמוכה יש יעילות נמוכה של זריחה; לכן, אופטיקה מתקדמת תהיה מועילה להקלטה כזו.
בנוסף, גם הפיזיולוגיה של הפרוסה חיונית. מאחר שניתוח ההדמיה מחייב שהפרוסות יהיו שלמות, יש צורך בטיפול בפרוסה הזהירה17. יתר על כן, מדדים שננקטו כדי לשמור על הכדאיות הפרוסה זמן רב יותר הם חשובים18.
המאמר הנוכחי מתאר את הפרוטוקול להכנת פרוסות, צביעת VSD ומדידות. המאמר מתאר גם את השיפורים של VSDs, מכשיר הדמיה ואופטיקה, ועוד ליטושים נוספים למערכת הניסיונית שאפשרה שיטה זו לשמש כמערכת פשוטה, רבת עוצמה וכמותית לצורך המחשה של שינוי המוח בפונקציות19,20,21,22,23,24,25. הטכניקה יכולה גם לשמש רבות לפוטנציאל לטווח ארוך באזור CA1 של היפוקמאל פרוסות1. יתר על כן, טכניקה זו שימושית גם הקלטה אופטית של פוטנציאל הממברנה תא עצבי אחד26.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפיזיולוגיה של הפרוסה חיונית. לאיסוף האות הנכון השימוש במערכת מסנני טבעת-ממברנה בפרוטוקול זה מבטיח שהפרוסה תישאר בריאה ובלתי מעוותת במהלך הפרוצדורה2,16,17. מערכות אחרות ניתן להשתמש כדי לשמור על פיזיולוגיה הפרוסה במהלך ההקלטה, אבל הפרוסה ל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TT קיבל את JSPS KAKENHI גרנט (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038, ו JP15K00413) מ MEXT ומענקים מהמשרד לבריאות, עבודה ורווחה (MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] ו H30 [18062156]). אנחנו רוצים להודות לנומרולאין (www.editage.jp) לעריכת שפה באנגלית.
Materials
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM – Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/ 0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
References
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation. Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).
- Homma, R., et al. Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).
- Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity. Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).
- Hill, D., Keynes, R. Opacity changes in stimulated nerve. The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).
- Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential. Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).
- Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System. Nature. 246 (5434), (1973).
- Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. Optical Methods for Monitoring Neuron Activity. Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. A large change in dye absorption during the action potential. Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).
- Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon. Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).
- Loew, L. M., et al. A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations. The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).
- Mullah, S., et al. Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System. The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).
- Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus. Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).
- Tominaga, T., Ichikawa, M. Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. , (2002).
- Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).
- Tanemura, K., et al. Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau. Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).
- Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation. Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).
- Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
- Juliandi, B., et al. Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid. Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).
- Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).
- Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Sakmann, B., Stuart, G. . Single-Channel Recording. , (1995).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices. Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).
- Mennerick, S., et al. Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function. The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).
- Canitano, R., Pallagrosi, M. Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories. Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).
- Anticevic, A., Murray, J. D. Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum. Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).
- Busche, M., Konnerth, A. Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).
- Knöpfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).
- Knöpfel, T. Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits. Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).
- Tominaga, T., Tominaga, Y. A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity. Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).
