Transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini Incelemek için Biolayer Interferometri (BLı) uygulaması
Summary
RNA polimeraz ile transkripsiyon faktörlerinin (TFs) etkileşimleri genellikle PULLDOWN asder kullanılarak incelenmiştir. GrgA ‘nın klamidiyal RNA polimeraz ile etkileşimini karakterize etmek için bir Biolayer Interferometri (BLı) teknolojisi uygulıyoruz. PULLDOWN analizlerine kıyasla, BLı gerçek zamanlı dernek ve dissociation algılar, daha yüksek hassasiyet sunar ve oldukça nicelidir.
Abstract
Transkripsiyon faktörü (TF), RNA polimeraz, başka bir TF ve/veya şablon DNA ‘Sı ile etkileşime girerek gen ifadesini düzenleyen bir proteindir. Grga, özellikle zorunlu hücre içi bakteriyel patojen klamidya ‘da bulunan yeni bir transkripsiyon aktivatörü. Benzeşme boncukları kullanarak protein PULLDOWN asdiyor GrgA iki σ faktörleri bağlar ortaya çıktı, yani σ66 ve σ28, hangi ürünleri farklılaşarak gelişimsel aşamalarında gerekli genler için organizatörler farklı setleri tanımak. Biz onaylamak ve daha fazla etkileşimleri karakterize BLı kullandık. BLI PULLDOWN üzerinde çeşitli avantajları gösterir: 1) bu bağlama ortakları arasında gerçek zamanlı dernek ve ayrışma ortaya çıkarır, 2) bu nicel kinetik parametreler üretir Bu özellikler, Chlamydia‘daki gen ifade yönetmeliğinde Grga ‘nın fizyolojik rollerini ve olası detaylı etkileşim mekanizmalarını anlamak için bize olanak sağladı. Biz bu nispeten ekonomik teknoloji son derece transkripsiyon ve diğer biyolojik süreçler eğitim için yararlı olabilir hayal.
Introduction
DNA ‘yı şablon olarak kullanan RNA molekülleri üreten transkripsiyon, Gen ifadesinin ilk adımıdır. RNA polimeraz (RNAP) holoenziminin bir hedef promotör1,2‘ ye bağlanması sonrasında bakteriyel RNA sentezi başlar. RNAP holoenzim (RNAPholo), organizatör sırasını tanımak için gerekli olan Multi-subunit katalitik çekirdeğinden (RNAPcore) ve σ faktörden oluşur. Transkripsiyon aktivizörleri ve baskıcılar, topluca TFs olarak adlandırılan, RNAPcore, σ faktörleri ve/veya DNA bağlayıcı bileşenleri ile gen ifadesi düzenler. Organizmaya bağlı olarak, genomunun önemli bir kısmı, fizyolojik ihtiyaçlara ve çevresel ipuçları3‘ e yanıt olarak transkripsiyon düzenleyen TFs ‘ye tahsis edilebilir.
Klamidya insan ve hayvanların çeşitli hastalıklarından sorumlu bir zorunlu hücre içi bakterinin4,5,6,7,8. Örneğin, klamidya trachomatis tartışmasız insanlarda dünya çapında bir numaralı cinsel yolla bulaşan patojen ve bazı az gelişmiş ülkelerde körlük önde gelen nedeni4,5. Klamidya , temel vücut (EB) ve retikül vücut (RB)9olarak adlandırılan iki alternatif hücresel form ile karakterize benzersiz bir gelişim döngüsüne sahiptir. Ancak EBs, hücre dışı bir ortamda hayatta kalabiliyorlar, proliferasyon kabiliyetine sahip değiller. EBs, ana hücreleri endositoz yoluyla girip, ana sitoplazmada bir vakumda daha büyük RBs ‘e, sonrası inokülasyon saatleri içinde ayırt ederler. Artık bulaşıcı değil, RBS ikili Fission ile çoğalırlar. Yaklaşık 20 h, onlar geri EBs ayırt etmeye başlar, hangi 30-70 civarında ana hücre çıkış h.
Klamidya gelişimsel döngüsünün ilerlemesi transkripsiyon ile düzenlenir. Yaklaşık 1.000 klamidya genlerinin bir büyük çoğunluğu, RBs ‘nin aktif olarak çoğaldığı orta döngü sırasında ifade edilse de, sadece az sayıda gen, EBs ‘nin girdinin ana hücrelerine girilmesinden hemen sonra dönüştürülmesini başlatmak için yazılmış EBs, RBs içine ve başka bir küçük genleri kümesi, KBS, EBs10,11farklılaşma sağlamak için transkripsiyonu veya giderek transkripsiyonu.
Klamidya genomu σ66, σ28 ve σ54gibi üç σ faktörü kodlıyor. E. coli ve diğer bakterilerin σ70 temizliği ile eşdeğer olan σ66, erken ve orta döngüdeki genlerin yanı sıra bazı geç genler ile ilgili promotörler tanınması nedeniyle, σ28 ve σ54 için gerekli olan Bazı geç genlerin transkripsiyonu. Çeşitli genlerin hem σ66bağlı promotör hem de σ28bağımlı Organizatör12‘ ye taşınması bilinmektedir.
Karmaşık bir gelişimsel döngüye rağmen, Chlamydiales13‘ te yalnızca az sayıda TFs bulunmuştur. GrgA (önceden varsayımsal bir protein CT504 c. trachomatis serovar D ve CTL0766 c. trachomatis L2) olarak açıklamalı bir klamidyaözgü TF başlangıçta σ66-bağımlı genler14aktivatörü olarak kabul edilir. Benzeşimi PULLDOWN deneyleri Grga hem σ66 ve DNA bağlayarak kendi transkripsiyon aktive gösterdiğini göstermiştir. İlginç bir şekilde, daha sonra bu GrgA ile σ28ile birlikte çökerek bulundu ve σ28‘ den bağımlı promotörler in vitro15‘ ten transkripsiyon aktifleştirir. GrgA ‘nın σ66 ve σ28için benzer veya farklı benzerlikleri olup olmadığını araştırmak için Bli ‘yi kullanmaya başvurdular. BLı asder, GrgA ‘nın σ66 ile bir 30 kat daha yüksek benzeşte σ28Ile etkileşiminin, grga ‘nın σ66bağımlı transkripsiyon ve σ28bağımlı transkripsiyon içinde diferansiyel roller oynayabilir olduğunu göstermiştir 15 yaşında.
BLI bir biyosensör ucunda immobilize protein katmanından yansıtan beyaz ışık girişim deseni algılar ve bir iç referans katmanı16karşılaştırır. Bu iki girişim deseninin analizi sayesinde BLı, biyosensörün ucuna bağlı protein miktarı hakkında değerli ve gerçek zamanlı bilgiler sağlayabilir. Biyosensör ucunu immobilize protein ligand olarak adlandırılır ve genellikle ortak bir antikor veya epitopu etiketi yardımıyla immobilize (örneğin, bir Poly-onun-veya biotin-Tag) bir ilişkili parçacık için bir yakınlık vardır (gibi NTA veya Streptavidin) biosensor ucunda. Biyosensörün ucunda ligand ile analit olarak adlandırılan ikincil bir proteinin bağlanması, biosensörlerin opaklığındaki değişimlere neden olur ve bu nedenle girişim desenlerinin değişikliklerine neden olur. Analitin farklı konsantrasyonlarda tekrarlandığında, BLI sadece nitel değil, aynı zamanda ligand ve analit16arasındaki yakınlık hakkında niceliksel bilgiler sağlayabilir.
Bilgimizin en iyisi, biz transkripsiyon15protein-protein etkileşimlerini karakterize etmek için BLI istihdam ilk oldu. Bu yayında, daha önce σ28bağlayıcı için gerekli olduğu gösterilmiştir bir Grga parçası, gerçekten bağlayıcı aracılık gösterir. Bu yazıda BLı ‘nin adımları ve bağlayıcı kinetiklerin BLı grafikleri ve parametreleri oluşturulması üzerinde duruluyor. Ligin ve analitlerin üretim (ve arıtma) yöntemleri burada kapsamındadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protein-protein etkileşimleri transkripsiyon ve diğer biyolojik süreçlerin düzenlenmesi için çok önemlidir. En sık PULLDOWN öğrenimi ile incelenmiştir. PULLDOWN analizlerinin gerçekleştirmek nispeten kolay olmasına rağmen, onlar kötü niceliksel ve zayıf ama biyolojik olarak anlamlı etkileşimleri algılamak için başarısız olabilir. Karşılaştırıldığında, bir ligand ve bir analit arasında gerçek zamanlı dernek ve ayrışma tespit ederek, BLI ilişkilendirme ve ayrışma oranı sabitler, y…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Sağlık Ulusal Enstitüleri (hibe # AI122034 ve AI140167) ve New Jersey Sağlık Vakfı (Grant # PC 20-18) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
References
- Vvedenskaya, I. O., et al. Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).
- Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective. Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).
- Visweswariah, S. S., Busby, S. J. Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones. Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).
- Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H. Trachoma. Lancet. 384 (9960), 2142-2152 (2014).
- WHO. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).
- Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children. The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).
- De Puysseleyr, K., et al. Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse. BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).
- Hulin, V., et al. Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry. Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).
- Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I. Chlamydia. Nature Review of Microbiol. 2 (7), 530-531 (2004).
- Belland, R. J., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).
- Tan, M., Tan, M., Bavoil , P. M. . Intracellular pathogens I: Chlamydiales. , 149-169 (2012).
- Domman, D., Horn, M. Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation. Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).
- Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).
- Desai, M., et al. Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).
- Joy, C., et al. Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).
- Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA). Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).
- Nelson, R. W., Krone, J. R. Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS). Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).
- Visentin, J., et al. Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).
- Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers. ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).
- Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).
- Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications. Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).
