Toepassing van Biolayer interferometrie (BLI) voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties in transcriptie

Transcriptie, die RNA moleculen produceert met behulp van DNA als template, is de allereerste stap van genexpressie. Bacteriële RNA-synthese begint na de binding van het RNA polymerase (rnap) holoenzym aan een doel promotor^1,2. Het RNAP-holoenzym (RNAPholo) bestaat uit een katalytische kern met meerdere subeenheden (RNAPcore) en een σ-factor, die nodig is voor het herkennen van de volgorde van de organisator. Transcriptie Activators en repressors, gezamenlijk genoemd TFs, reguleren de genexpressie door de bindende componenten van de RNAPcore, σ factoren, en/of DNA. Afhankelijk van het organisme kan een aanzienlijk deel van het genoom worden gewijd aan TFs die transcriptie reguleren in reactie op fysiologische behoeften en omgevings aanwijzingen³.

Chlamydia is een verplicht intracellulaire bacterie die verantwoordelijk is voor een verscheidenheid aan ziekten bij mensen en dieren^4,5,6,7,8. Chlamydia trachomatis is bijvoorbeeld aantoonbaar het nummer één seksueel overdraagbare pathogeen bij mensenwereld wijd, en een leidende oorzaak van blindheid in sommige onderontwikkelde landen^4,5. Chlamydia heeft een unieke ontwikkelingscyclus die wordt gekenmerkt door twee alternerende cellulaire vormen die het elementaire lichaam (EB) en Reticulate Body (RB)⁹worden genoemd. Terwijl EBs in een extracellulaire omgeving kan overleven, zijn ze niet in staat tot proliferatie. EBs Voer cellen in door middel van endocytose en differentiëren in grotere RBs in een vacuole in het host cytoplasma binnen uur na inoculatie. Niet langer infectieuze, RBs prolifereren door binaire splijting. Rond 20 h, ze beginnen te differentiëren terug naar de EBs, die de gastheer cellen rond 30-70 h verlaten.

Progressie van de chlamydiale ontwikkelingscyclus wordt gereguleerd door transcriptie. Overwegende dat een overgrote meerderheid van de bijna 1.000 chlamydiale genen wordt uitgedrukt tijdens de midcyclus waarin RBs actief repliceert, slechts een klein aantal genen wordt direct na de invoer van EBs in de gastheer cellen getranscribeerd om de omzetting van EBs in RBs, en een andere kleine reeks genen worden getranscribeerd of steeds getranscribeerd om de differentiatie van RBs in EBs^10,11mogelijk te maken.

Het chlamydiale genoom codeert drie σ-factoren, namelijk σ⁶⁶, σ²⁸ en σ⁵⁴. σ⁶⁶, die gelijkwaardig is aan de huishoudservice σ⁷⁰ van E. coli en andere bacteriën, is verantwoordelijk voor het herkennen van promotors van vroege en mid-Cycle genen en sommige late genen, terwijl σ²⁸ en σ⁵⁴ nodig zijn voor de transcriptie van bepaalde late genen. Er zijn verschillende genen waarvan bekend is dat ze zowel een σ⁶⁶-afhankelijke promotor als een σ²⁸-afhankelijke promotor¹²dragen.

Ondanks een ingewikkelde ontwikkelingscyclus is er slechts een klein aantal TFs gevonden in Chlamydiae¹³. GrgA (eerder geannoleerd als een hypothetisch proteïne CT504 in c. trachomatis Serovar D en CTL0766 in c. trachomatis L2) is een Chlamydia-specifieke TF die aanvankelijk wordt herkend als een activator van σ⁶⁶-afhankelijke genen¹⁴. Affiniteit keuze assays hebben aangetoond dat grga hun transcriptie activeert door zowel σ⁶⁶ als DNA te binden. Interessant is dat het later werd gevonden met die GrgA ook co-precipiteert met σ²⁸, en activeert transcriptie van σ²⁸-afhankelijke promotors in vitro¹⁵. Om te onderzoeken of GrgA vergelijkbare of verschillende affiniteiten heeft voor σ⁶⁶ en σ²⁸, hebben we gebruik gemaakt van bli. BLI assays hebben aangetoond dat GrgA samenwerkt met σ⁶⁶ met een 30-voudige hogere affiniteit dan met σ²⁸, wat suggereert dat grga differentiële rollen kan spelen in σ⁶⁶-afhankelijke transcriptie en σ²⁸-afhankelijke transcriptie ¹⁵.

BLI detecteert het interferentiepatroon van wit licht dat reflecteert van een laag geïmmobiliseerd eiwit op de punt van een biosensor en vergelijkt het met die van een interne referentielaag¹⁶. Door de analyse van deze twee interferentie patronen kan BLI waardevolle en real-time informatie verschaffen over de hoeveelheid eiwit gebonden aan de punt van de biosensor. Het eiwit dat wordt geïmmobiliseerd tot de punt van de biosensor wordt aangeduid als de ligand, en is over het algemeen geïmmobiliseerd met behulp van een gemeenschappelijk antilichaam of epitoop tag (bijvoorbeeld, een poly-his-of Biotine-tag) die affiniteit heeft voor een bijbehorend deeltje (zoals NTA of Streptavidine) op de punt van de biosensor. De binding van een secundair eiwit, aangeduid als de analyt, met de ligand aan de punt van de biosensor creëert veranderingen in de ondoorzichtigheid van de biosensor en resulteert daarom in veranderingen in interferentie patronen. Indien herhaald over verschillende concentraties van de analyt, kan BLI niet alleen kwalitatieve, maar ook kwantitatieve informatie verschaffen over de affiniteit tussen de ligand en de analyt¹⁶.

Naar het beste van onze kennis, waren we de eersten die BLI gebruiken om eiwit-eiwit interacties te karakteriseren in transcriptie¹⁵. In deze publicatie tonen we aan dat een GrgA-fragment, dat voorheen vereist was voor σ²⁸-binding, inderdaad de binding bemiddelt. Dit manuscript richt zich op stappen van de BLI-assays en het genereren van BLI-grafieken en parameters van bindende kinetiek. Methoden voor de productie (en zuivering) van liganden en analyten worden hier niet behandeld.