Application de biocouches interferométrie (BLI) pour étudier les interactions protéines-protéines dans la transcription

La transcription, qui produit des molécules d’ARN en utilisant l’ADN comme modèle, est la toute première étape de l’expression des gènes. La synthèse bactérienne de l’ARN commence après la liaison de l’holoenzyme de polymérase d’ARN (RNAP) à un promoteur cible^1,2. L’holoenzyme RNAP (RNAPholo) est composé d’un noyau catalytique multi-subunit (RNAPcore) et d’un facteur de ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ Les activateurs et répresseurs de transcription, collectivement appelés TFs, règlent l’expression de gène par les composants de liaison du RNAPcore, des facteurs de ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ Selon l’organisme, une partie importante de son génome peut être consacrée aux TF qui régulent la transcription en réponse aux besoins physiologiques et aux indices environnementaux³.

La chlamydia est une bactérie intracellulaire obligatoire responsable d’une variété de maladies chez les humains et les animaux^4,5,6,7,8. Par exemple, Chlamydia trachomatis est sans doute le principal agent pathogène transmis sexuellement chez l’homme dans le monde entier, et l’une des principales causes de cécité dans certains pays sous-développés^4,5. La chlamydia a un cycle de développement unique caractérisé par deux formes cellulaires alternées appelées le corps élémentaire (EB) et le corps réticulé (RB)⁹. Alors que les EB sont capables de survivre dans un environnement extracellulaire, ils sont incapables de prolifération. Les EB pénètrent dans les cellules hôtes par endocytose et se différencient en rBs plus grands dans un vacuole dans le cytoplasme hôte dans les heures suivant l’inoculation. N’infectieux plus, les RB prolifèrent par fission binaire. Autour de 20 h, ils commencent à se différencier de nouveau aux EB, qui sortent des cellules d’hôte autour de 30-70 h.

La progression du cycle de développement chlamydiale est réglée par transcription. Alors qu’une supermajorité des près de 1 000 gènes chlamydiales s’expriment au cours du cycle intermédiaire au cours duquel les RB se reproduisent activement, seul un petit nombre de gènes sont transcrits immédiatement après l’entrée des EB dans les cellules hôtes pour initier la conversion de Les EB dans les RB, et un autre petit ensemble de gènes sont transcrits ou de plus en plus transcrits pour permettre la différenciation des RB en IS^10,11.

Le génome chlamydial code trois facteurs, à savoir⁶⁶,²⁸ et⁵⁴. ⁶⁶, ce qui équivaut à l’entretien ménager de⁷⁰ de E. coli et d’autres bactéries, est responsable de la reconnaissance des promoteurs des gènes du début et du milieu du cycle ainsi que de certains gènes en retard, alors que²⁸ et⁵⁴ sont nécessaires pour la transcription de certains gènes tardifs. Plusieurs gènes sont connus pour porter à la fois un promoteur de⁶⁶-dépendants et un promoteur de²⁸-dépendants¹².

Malgré un cycle de développement compliqué, seul un petit nombre de TF ont été trouvés dans le chlamydiae¹³. GrgA (précédemment annoté comme une protéine hypothétique CT504 dans C. trachomatis serovar D et CTL0766 dans C. trachomatis L2) est une Chlamydia-spécifique TF initialement reconnu comme un activateur de⁶⁶gènes dépendants¹⁴. Les essais d’affinité ont démontré que GrgA active leur transcription en liant à la fois l’ADN⁶⁶ et l’ADN. Fait intéressant, il a été trouvé plus tard avec que GrgA co-précipite également avec²⁸, et active la transcription à partir de²⁸-promoteurs dépendants in vitro¹⁵. Pour déterminer si GrgA a des affinités similaires ou différentes pour⁶⁶ et²⁸euros, nous avons eu recours à bli. Les essais DE BLI ont montré que GrgA interagit avec⁶⁶ à une affinité 30 fois plus élevée qu’avec²⁸, suggérant que GrgA peut jouer des rôles différentiels dans la transcription de^’66-dépendant et ’28 -transcription dépendante ¹⁵.

BLI détecte le modèle d’interférence de la lumière blanche qui se reflète à partir d’une couche de protéine immobilisée à l’extrémité d’un biocapteur et la compare à celle d’une couche de référence interne¹⁶. Grâce à l’analyse de ces deux modèles d’interférence, BLI peut fournir des informations précieuses et en temps réel sur la quantité de protéines liées à la pointe du biocapteur. La protéine immobilisée à l’extrémité du biocapteur est appelée ligand, et est généralement immobilisée à l’aide d’un anticorps ou d’une étiquette épitope commune (p. ex., un poly-his- ou biotine-tag) qui a une affinité pour une particule associée (comme ntA ou Streptavidin) sur la pointe du biocapteur. La liaison d’une protéine secondaire, appelée analyte, avec le ligand à l’extrémité du biocapteur crée des changements dans l’opacité du biocapteur et entraîne donc des changements dans les modèles d’interférence. Lorsqu’il est répété sur différentes concentrations de l’analyte, BLI peut fournir non seulement des informations qualitatives mais aussi quantitatives sur l’affinité entre le ligand et l’analyte¹⁶.

Au meilleur de notre connaissance, nous avons été les premiers à employer BLI pour caractériser les interactions protéine-protéine dans la transcription¹⁵. Dans cette publication, nous démontrons qu’un fragment de GrgA, qui était auparavant démontré comme étant nécessaire pour²⁸-contraignant, en effet médiatise la liaison. Ce manuscrit se concentre sur les étapes des essais BLI, et la génération de graphiques BLI et les paramètres de la cinétique de liaison. Les méthodes de production (et de purification) de ligands et d’analytes ne sont pas couvertes ici.