تطبيق قياس التداخل الحيوي (BLI) لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في النسخ
Summary
عادة ما تدرس تفاعلات عوامل النسخ (TFs) مع بوليميراز الحمض النووي الريبي باستخدام اختبار السحب. نحن نطبق تقنية قياس التداخل الحيوي (BLI) لتوصيف تفاعل GrgA مع بوليميراز الحمض النووي الريبي الكلاميديا. بالمقارنة مع الاختبارات المنسدلة، بلي يكشف في الوقت الحقيقي الارتباط والتفكك، ويقدم حساسية أعلى، وكمية للغاية.
Abstract
عامل النسخ (TF) هو البروتين الذي ينظم التعبير الجيني من خلال التفاعل مع بوليميراز الحمض النووي الريبي، TF آخر، و / أو قالب الحمض النووي. GrgA هو منشط النسخ رواية وجدت على وجه التحديد في الممرض البكتيري داخل الخلايا ملزمة الكلاميديا. وقد كشفت اختبارات سحب البروتين باستخدام الخرز التقارب أن GrgA يربط عاملين، وهما66 و 28 ، والتي تعترف مجموعات مختلفة من المروجين للجينات التي هي مطلوبة بشكل تفاضلي في مراحل التنمية. وقد استخدمنا هذا النظام لتأكيد التفاعلات ومواصلة توصيفها. BLI يوضح العديد من المزايا على الانسحاب: 1) فإنه يكشف في الوقت الحقيقي الارتباط والتفكك بين الشركاء ملزمة، 2) أنه يولد المعلمات الحركية الكمية، و 3) فإنه يمكن الكشف عن الروابط التي غالبا ما تفشل الاختبارات المنسدلة للكشف. وقد مكنتنا هذه الخصائص من استنتاج الأدوار الفسيولوجية للGrgA في تنظيم التعبير الجيني في الكلاميديا، وآليات التفاعل التفصيلية الممكنة. ونحن نتصور أن هذه التكنولوجيا بأسعار معقولة نسبيا يمكن أن تكون مفيدة للغاية لدراسة النسخ والعمليات البيولوجية الأخرى.
Introduction
النسخ، الذي ينتج جزيئات الحمض النووي الريبي باستخدام الحمض النووي كقالب، هو الخطوة الأولى جدا من التعبير الجيني. يبدأ تخليق الحمض النووي الريبي البكتيري بعد ربط بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNAP) الهولوإنزيم إلى المروج المستهدف1،2. يتكون إنزيم الهولوانزيم RNAP (RNAPholo) من نواة محفزة متعددة الوحدات الفرعية (RNAPcore) وعامل ، وهو مطلوب للتعرف على تسلسل المروج. تقوم أجهزة النسخ وأجهزة الكبت، التي يطلق عليها مجتمعة بـ TFs، بتنظيم التعبير الجيني من خلال المكونات الملزمة لـ RNAPcore، و/أو العوامل، و/أو الحمض النووي. اعتمادا على الكائن الحي، يمكن تخصيص جزء كبير من الجينوم لTFs التي تنظم النسخ استجابة للاحتياجات الفسيولوجية والعظة البيئية3.
الكلاميديا هي بكتيريا داخل الخلايا ملزمة مسؤولة عن مجموعة متنوعة من الأمراض في البشر والحيوانات4،5،6،7،8. على سبيل المثال، يمكن القول أن الكلاميديا تراخوماتيهوال هو الممرض رقم واحد المنقولة جنسيا في البشر في جميع أنحاء العالم، والسبب الرئيسي للعمى في بعض البلدان المتخلفة4،5. الكلاميديا لديها دورة تنموية فريدة من نوعها تتميز باثنين من الأشكال الخلوية بالتناوب تسمى الجسم الابتدائي (EB) والجسم reticulate (RB)9. في حين أن الـ EBs قادرة على البقاء في بيئة خارج الخلية، فهي غير قادرة على الانتشار. تدخل الـ EBs الخلايا المضيفة من خلال بطانة الرحم وتفرق في الـ RBs أكبر في vacuole في السيتوبلازم المضيف في غضون ساعات بعد التلقيح. لم تعد معدية، تنتشر الـ RBs من خلال الانشطار الثنائي. حوالي 20 ساعة، فإنها تبدأ في التمييز مرة أخرى إلى EBs، التي تخرج من الخلايا المضيفة حول 30-70 ساعة.
يتم تنظيم تطور دورة النمو الكلاميديا عن طريق النسخ. في حين يتم التعبير عن الغالبية العظمى من الجينات الكلاميديا ما يقرب من 1000 خلال الدورة المتوسطة التي يتم خلالها تكرار RBs بنشاط، يتم نسخ عدد قليل فقط من الجينات مباشرة بعد دخول EBs إلى الخلايا المضيفة لبدء تحويل يتم نسخ EBs إلى RBs، ومجموعة صغيرة أخرى من الجينات أو نسخها بشكل متزايد لتمكين التمايز بين RBs في EBs10و11.
الجينوم الكلاميديا ترميز ثلاثة عوامل ، وهي66،28 و54. 66، وهو ما يعادل التدبير المنزلي 70 من القولونية والبكتيريا الأخرى ، هو المسؤول عن التعرف على المروجين للجينات في وقت مبكر ومنتصف دورة فضلا عن بعض الجينات في وقت متأخر ، في حين أن28 و54 مطلوبة ل نسخ بعض الجينات المتأخرة. ومن المعروف أن العديد من الجينات تحمل كل من المروج66التابعة والمروج28تعتمدعلى 12.
على الرغم من دورة التنمية المعقدة، تم العثور على عدد قليل فقط من TFs في الكلاميديا13. GrgA (مشروح سابقا كبروتين افتراضي CT504 في C. التراخوماتيسي المصلي D و CTL0766 في C. التراخوماتيس L2) هو TF الكلاميديا محددة المعترف بها فيالبداية كمنشط من الجينات المعتمدةعلى 6614. وقد أظهرت اختبارات الانسحاب التقارب أن GrgA ينشط النسخ عن طريق ربط كل من66 والحمض النووي. ومن المثير للاهتمام، تم العثور عليه في وقتلاحق مع أن GrgA أيضا شارك في التعجيل مع 28 ، وينشط النسخ من المروجين28تعتمد في المختبر15. للتحقيق في ما إذا كان GrgA لديه تقارب مماثل أو مختلف ل66 و 28 ، لجأنا إلى استخدام BLI. وقد أظهرت الاختبارات BLI أن GrgA يتفاعل مع 66 في تقارب أعلى 30 أضعاف من مع28، مما يشير إلى أن GrgA قد تلعب أدوارا تفاضلية في 66 – النسخ المعتمدة و28 – النسخ تعتمد على 15.
يكتشف BLI نمط التداخل للضوء الأبيض الذي يعكس من طبقة من البروتين المعطلة على طرف جهاز استشعار حيوي ويقارنه بطبقة المرجع الداخلي16. ومن خلال تحليل هذين النوعين من التداخل، يمكن لـ BLI توفير معلومات قيمة وفي الوقت الحقيقي عن كمية البروتين المرتبطة بطرف جهاز الاستشعار الحيوي. يُشار إلى البروتين المعطلة إلى طرف جهاز الاستشعار الحيوي باسم الرباط، ويتم تعطيله بشكل عام بمساعدة جسم مضاد شائع أو علامة epitope (على سبيل المثال، علامة بولي-له أو البيوتين) التي لها تقارب للجسيمات المرتبطة بها (مثل NTA أو NTA أو NTA Streptavidin) على طرف جهاز الاستشعار الحيوي. ربط بروتين ثانوي، يشار إليه باسم analyte، مع الرباط في طرف جهاز الاستشعار الحيوي يخلق تغييرات في عتامة جهاز الاستشعار الحيوي، وبالتالي يؤدي إلى تغييرات في أنماط التداخل. عندما تتكرر على تركيزات مختلفة من analyte، يمكن أن توفر BLI ليس فقط معلومات نوعية ولكن أيضا كمية حول التقارب بين ligand وanalyte16.
على حد علمنا، كنا أول من استخدم BLI لوصف التفاعلات البروتين البروتين في النسخ15. في هذا المنشور، نثبت أن جزء GrgA، الذي ثبتفي السابق أنه مطلوب لـ 28-binding، يتوسط بالفعل في الإلزام. تركز هذه المخطوطة على خطوات من الاختبارات BLI، وتوليد الرسوم البيانية BLI والمعلمات من الحركية ملزمة. لا يتم تغطية طرق لإنتاج (وتنقية) من الأربطة وanalytes هنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
التفاعلات البروتين البروتينية حاسمة لتنظيم النسخ والعمليات البيولوجية الأخرى. يتم دراستها الأكثر شيوعا من خلال الاختبارات الانسحاب. وعلى الرغم من أن عمليات السحب سهلة الأداء نسبياً، فإنها كمية سيئة وقد تفشل في الكشف عن تفاعلات ضعيفة ولكنها ذات مغزى من الناحية البيولوجية. في المقابل، من …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة (المنح رقم AI122034 وAI140167) ومؤسسة نيو جيرسي الصحية (Grant # PC 20-18).
Materials
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
References
- Vvedenskaya, I. O., et al. Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).
- Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective. Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).
- Visweswariah, S. S., Busby, S. J. Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones. Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).
- Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H. Trachoma. Lancet. 384 (9960), 2142-2152 (2014).
- WHO. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).
- Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children. The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).
- De Puysseleyr, K., et al. Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse. BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).
- Hulin, V., et al. Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry. Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).
- Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I. Chlamydia. Nature Review of Microbiol. 2 (7), 530-531 (2004).
- Belland, R. J., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).
- Tan, M., Tan, M., Bavoil , P. M. . Intracellular pathogens I: Chlamydiales. , 149-169 (2012).
- Domman, D., Horn, M. Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation. Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).
- Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).
- Desai, M., et al. Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).
- Joy, C., et al. Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).
- Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA). Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).
- Nelson, R. W., Krone, J. R. Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS). Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).
- Visentin, J., et al. Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).
- Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers. ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).
- Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).
- Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications. Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).
