Summary

Applicazione dell'interferometria biostrato (BLI) per lo studio delle interazioni tra proteine e proteine nella trascrizione

Published: July 26, 2019
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Summary

Le interazioni dei fattori di trascrizione (TF) con la polimerasi dell’RNA sono di solito studiate utilizzando saggi pulldown. Applichiamo una tecnologia di interferometria biostrato (BLI) per caratterizzare l’interazione di GrgA con la mistidiaRNA polimerasi. Rispetto ai test pulldown, BLI rileva l’associazione e la dissociazione in tempo reale, offre una maggiore sensibilità ed è altamente quantitativa.

Abstract

Un fattore di trascrizione (TF) è una proteina che regola l’espressione genica interagendo con la polimerasi dell’RNA, un altro TF e/o il DNA del modello. GrgA è un nuovo attivatore di trascrizione trovato specificamente nel patogeno batterico intracellulare obbligatorio Chlamydia. L’abbattimenti delle proteine che utilizzano perline di affinità hanno rivelato che laGrgA lega due fattori, vale a dire ilvalore di 66 , che riconoscono diversi gruppi di promotori per i geni i cui prodotti sono necessari in modo differenziale nelle fasi di sviluppo. Abbiamo usato BLI per confermare e caratterizzare ulteriormente le interazioni. BLI dimostra diversi vantaggi rispetto al pulldown: 1) Rivela l’associazione in tempo reale e la dissociazione tra i partner di legame, 2) Genera parametri cinetici quantitativi, e 3) Può rilevare attacchi che i saggi pulldown spesso non riescono a rilevare. Queste caratteristiche ci hanno permesso di dedurre i ruoli fisiologici di GrgA nella regolazione dell’espressione genica in Chlamydiae possibili meccanismi di interazione dettagliati. Prevediamo che questa tecnologia relativamente conveniente può essere estremamente utile per studiare la trascrizione e altri processi biologici.

Introduction

La trascrizione, che produce molecole di RNA usando il DNA come modello, è il primo passo dell’espressione genica. La sintesi dell’RNA batterica inizia dopo il legame dell’ologassi dell’RNA polimerasi (RNAP) a un promotore bersaglio1,2. L’oloenzima RNAP (RNAPholo) è costituito da un nucleo catalitico multi-subunità (RNAPcore) e da un fattore di z, che è necessario per riconoscere la sequenza promotrice. Attivatori di trascrizione e repressori, collettivamente ritiditi TF, regolano l’espressione genica attraverso i componenti di legame dell’RNAPcore, dei fattori e/o del DNA. A seconda dell’organismo, una parte significativa del suo genoma può essere dedicata ai TF che regolano la trascrizione in risposta a i bisogni fisiologici e i segnali ambientali3.

La clamidia è un batterio intracellulare obbligato responsabile di una varietà di malattie nell’uomo e negli animali4,5,6,7,8. Ad esempio, la clamidia transatide è probabilmente il numero uno patogeno sessualmente trasmissibile negli esseri umani in tutto il mondo, e una delle principali cause di cecità in alcuni paesi sottosviluppati4,5. La clamidia ha un ciclo di sviluppo unico caratterizzato da due forme cellulari alternate definite corpo elementare (EB) e corpo reticolato (RB)9. Mentre, EBs sono in grado di sopravvivenza in un ambiente extracellulare, sono incapaci di proliferazione. Gli EB entrano nelle cellule ospiti attraverso l’endocitosi e si differenziano in MB più grandi in un vacuolo nel citoplasma ospite entro ore dopo l’inoculazione. Non più infettivi, gli MB proliferano attraverso la fissione binaria. Circa 20 h, iniziano a differenziarsi di nuovo agli EB, che escono dalle celle ospiti intorno a 30-70 h.

La progressione del ciclo di sviluppo della clamidia è regolata dalla trascrizione. Mentre una supermaggioranza dei quasi 1.000 geni clamidici è espressa durante il ciclo intermedio durante il quale gli RB si stanno replicando attivamente, solo un piccolo numero di geni viene trascritto immediatamente dopo l’ingresso di EB nelle cellule ospiti per avviare la conversione di Gli EB in MB e un altro piccolo insieme di geni sono trascritti o sempre più trascritti per consentire la differenziazione degli MB in EB10,11.

Il genoma clamidiale codifica tre fattori, vale a dire66,28 e54. 66, che è equivalente alla pulizia di 70 e altri batteri, è responsabile del riconoscimento dei promotori di geni precoci e a metà ciclo, nonché di alcuni geni in ritardo, mentre sono necessari28 e 54 la trascrizione di alcuni geni tardivi. Sono noti che diversi geni trasportano sia un promotore dipendente da66usd che un promotore dipendente da28USD 12.

Nonostante un ciclo di sviluppo complicato, solo un piccolo numero di TF sono stati trovati in clamidiae13. GrgA (precedentemente annotato come una proteina ipotetica CT504 in C. trachomatis serovar D e CTL0766 in C. trachomatis L2) è un TF specifico di Chlamydiainizialmente riconosciuto come un attivatore di geni dipendenti da66. I saggi di tracciamento dell’affinità hanno dimostrato che GrgA attiva la loro trascrizione legando sia il DNA di66 che quello del DNA. È interessante notare che, in seguito è stato trovato con che GrgA co-precipita anche con28, e attiva la trascrizione da28-dipendentipromotori in vitro15. Per verificare se GrgA ha affinità simili o diverse per i valori66 e28, abbiamo fatto ricorso all’utilizzo di BLI. I saggi BLI hanno dimostrato che il GrgA interagisce con 66 volte con un’affinità 30 volte superiore rispetto a quella di28, suggerendo che GrgA può svolgere ruoli differenziali nella trascrizione dipendente da66USD e nella trascrizione dipendente da28 15.

BLI rileva il modello di interferenza della luce bianca che si riflette da uno strato di proteine immobilizzate sulla punta di un biosensore e lo confronta con quello di un livello di riferimento interno16. Attraverso l’analisi di questi due modelli di interferenza, BLI può fornire informazioni preziose e in tempo reale sulla quantità di proteine legate alla punta del biosensore. La proteina che viene immobilizzata sulla punta del biosensore è chiamata ligando, ed è generalmente immobilizzata con l’aiuto di un anticorpo comune o di un tag epitopo (ad esempio, un poli-His- o biotin-tag) che ha un’affinità per una particella associata (come NTA o biotin-tag) che ha un’affinità per una particella associata (come NTA o biotina-tag) che ha un’affinità per una particella associata (come NTA o biotin-tag) che ha un’affinità per una particella associata (come NTA o biotina-tag) che ha un’affinità per una particella associata (come NTA o biotin-tag) che ha un’affinità per una particella associata (come NTA o biotin-tag) che ha un’affinità per una particella associata (come NTA o biotin-tag) che ha un Streptavidin) sulla punta del biosensore. Il legame di una proteina secondaria, indicato come analita, con il ligando sulla punta del biosensore crea cambiamenti nell’opacità del biosensore e quindi si traduce in cambiamenti nei modelli di interferenza. Quando si ripete su diverse concentrazioni dell’analita, BLI può fornire non solo informazioni qualitative ma anche quantitative sull’affinità tra il ligando e l’analita16.

Per quanto ne sappiamo, siamo stati i primi ad impiegare BLI per caratterizzare le interazioni proteina-proteina nella trascrizione15. In questa pubblicazione, dimostriamo che un frammento di GrgA, che in precedenza è stato dimostrato essere necessario per l’associazione28,media effettivamente l’associazione. Questo manoscritto si concentra sui passi dei saggi BLI e sulla generazione di grafici BLI e parametri di cinetica legante. I metodi per la produzione (e la purificazione) di ligandi e analiti non sono coperti qui.

Protocol

1. Preparazione delle proteine Utilizzare un sacchetto di dialisi (con una dimensione di taglio appropriata) per dialisipare ogni proteina da utilizzare per i saggi BLI (compresi sia il ligando His-tagged che l’analyte) contro 1.000 volumi del buffer BLI (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM MGCl2 , 0,1 mM DTT, pH 8,0, pre-raffreddato a 4 gradi centigradi) a 4 gradi centigradi per 4 h.NOTA: I saggi BLI richiedono che il ligando sia presente a concentrazioni che saturano i siti di legam…

Representative Results

Attraverso i test BLI, in precedenza abbiamo stabilito che il legame di GrgA a28 è dipendente da una regione media di 28 amminoacidi (residui 138-165) di GrgA15. Di conseguenza, rispetto a GrgA (NH-GrgA) a lunghezza piena etichettati con N-terminale, un costrutto di delezione GrgA privo di questa regione (NH-GrgA-138-165) ha registrato una diminuzione del tasso di associazione e un aumento del tasso di dissociazione, che ha portato a una perdita complessiva di 3 milioni di affinità (<…

Discussion

Le interazioni tra proteine e proteine sono cruciali per la regolazione della trascrizione e di altri processi biologici. Sono più comunemente studiati attraverso i saggi pulldown. Anche se i saggi pulldown sono relativamente facili da eseguire, sono scarsamente quantitativi e potrebbero non riuscire a rilevare interazioni deboli ma biologicamente significative. In confronto, rilevando l’associazione e la dissociazione in tempo reale tra un ligando e un analita, BLI fornisce costanti di associazione e tasso di dissociaz…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da National Institutes of Health (Grants – AI122034 e AI140167) e dalla New Jersey Health Foundation (Grant – PC 20-18).

Materials

BLItz machine ForteBio 45-5000
Dialysis tubing cellulose membrane MilliporeSigma D9652
Dip and Read Ni-NTA biosensor tray ForteBio 18-5101 Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins
Drop holder ForteBio 45-5004
PCR tubes (0.2 mL) Thomas Scientific CLS6571
Microcentrifuge tubes (black) Thermo Fisher Scientific 03-391-166
Kimwipes Thermo Fisher Scientific 06-666A
DTT Thermo Fisher Scientific R0861
EDTA MilliporeSigma E6758
MgCl2 MilliporeSigma M8266
NaCl MilliporeSigma S9888
Tris-HCl GoldBio T095100

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Cite This Article
Desai, M., Di, R., Fan, H. Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription. J. Vis. Exp. (149), e59687, doi:10.3791/59687 (2019).

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