Aplicación de la interferometría de Biolayer (BLI) para el estudio de las interacciones proteínas y proteínas en la transcripción

La transcripción, que produce moléculas de ARN utilizando el ADN como plantilla, es el primer paso de la expresión génica. La síntesis de ARN bacteriano comienza después de la unión de la holoenzima de ARN polimerasa (RNAP) a un promotor objetivo^1,2. La holoenzima RNAP (RNAPholo) se compone de un núcleo catalítico multisubunidad (RNAPcore) y un factor de -, que es necesario para reconocer la secuencia promotora. Los activadores y represores de transcripción, llamados colectivamente TF, regulan la expresión génica a través de los componentes de unión del ARNPcore, los factores y/o el ADN. Dependiendo del organismo, una parte significativa de su genoma puede dedicarse a los TF que regulan la transcripción en respuesta a las necesidades fisiológicas y las señales ambientales³.

La clamidia es una bacteria intracelular obligatoria responsable de una variedad de enfermedades en humanos y animales^4,5,6,7,8. Por ejemplo, La clamidia trachomatis es posiblemente el patógeno de transmisión sexual número uno en humanos en todo el mundo, y una de las principales causas de ceguera en algunos países subdesarrollados^4,5. La clamidia tiene un ciclo de desarrollo único caracterizado por dos formas celulares alternasque se denominan cuerpo elemental (EB) y reticulado cuerpo (RB) 9. Mientras que, los EB son capaces de sobrevivir en un entorno extracelular, son incapaces de proliferar. Los EB entran en las células huésped a través de la endocitosis y se diferencian en RBs más grandes en una vacuola en el citoplasma del huésped en cuestión de horas después de la inoculación. Ya no son infecciosos, los RAB proliferan a través de la fission binaria. Alrededor de 20 h, comienzan a diferenciar de nuevo a los EB, que salen de las células anfitrionas alrededor de 30-70 h.

La progresión del ciclo de desarrollo clamidia está regulada por la transcripción. Mientras que una supermayoría de los casi 1.000 genes clamidiados se expresan durante el ciclo medio durante el cual los BRAD se replican activamente, sólo un pequeño número de genes se transcriben inmediatamente después de la entrada de los EB en las células huésped para iniciar la conversión de Los EB en los BB, y otro pequeño conjunto de genes se transcriben o se transcriben cada vez más para permitir la diferenciación de los BB en los EB^10,11.

El genoma chlamidia codifica tres factores de los que se codifican en los documentos⁶⁶,²⁸ y⁵⁴. ⁶⁶, que es equivalente a la limpieza⁷⁰ de E. coli y otras bacterias, es responsable de reconocer a los promotores de genes de ciclo temprano y medio, así como a algunos genes tardíos, mientras que los modelos²⁸ y⁵⁴ son necesarios para la transcripción de ciertos genes tardíos. Se sabe que varios genes llevan tanto a un promotor dependientede⁶⁶o 66 o a un promotor dependiente de²⁸o2.

A pesar de un ciclo de desarrollo complicado, sólo un pequeño número de TFs se han encontrado en clamidia¹³. GrgA (anteriormente anotado como una proteína hipotética CT504 en C. trachomatis serovar D y CTL0766 en C. trachomatis L2) es un TF específico de Clamydiainicialmente reconocido como un activador de⁶⁶genes dependientes¹⁴. Los ensayos desplegables de afinidad han demostrado que GrgA activa su transcripción al unir tanto el n.o⁶⁶ como el ADN. Curiosamente, más tarde se encontró con que GrgA también coprecipita con^{el 28}, y activa la transcripción de los promotores dependientes de²⁸euros in vitro¹⁵. Para investigar si GrgA tiene afinidades similares o diferentes por⁶⁶ y²⁸euros, recurrimos al uso de BLI. Los ensayos de BLI han demostrado que GrgA interactúa con^{el 66} o 66 con una afinidad 30 veces mayor que con^{el 28,}lo que sugiere que GrgA puede desempeñar roles diferenciales en la transcripción dependiente de⁶⁶y la transcripción dependiente de²⁸euros ¹⁵.

BLI detecta el patrón de interferencia de la luz blanca que se refleja a partir de una capa de proteína inmovilizada en la punta de un biosensor y lo compara con el de una capa de referencia interna^16. A través del análisis de estos dos patrones de interferencia, BLI puede proporcionar información valiosa y en tiempo real sobre la cantidad de proteína unida a la punta del biosensor. La proteína que se inmoviliza a la punta del biosensor se conoce como el ligando, y generalmente se inmoviliza con la ayuda de un anticuerpo común o etiqueta de epítopo (por ejemplo, una etiqueta poli-His- o biotina) que tiene una afinidad por una partícula asociada (como NTA o Streptavidin) en la punta del biosensor. La unión de una proteína secundaria, conocida como analito, con el ligando en la punta del biosensor crea cambios en la opacidad del biosensor y, por lo tanto, da lugar a cambios en los patrones de interferencia. Cuando se repite sobre diferentes concentraciones del analito, BLI puede proporcionar no sólo información cualitativa, sino también cuantitativa sobre la afinidad entre el ligando y el analito¹⁶.

Hasta donde sabemos, fuimos los primeros en emplear a BLI para caracterizar las interacciones proteína-proteína en la transcripción^15. En esta publicación, demostramos que un fragmento de GrgA, que anteriormente se mostraba necesario para el enlace de²⁸euros, de hecho media el enlace. Este manuscrito se centra en los pasos de los ensayos BLI y la generación de gráficos BLI y parámetros de cinética de encuadernación. Los métodos para la producción (y purificación) de ligandos y analitos no están cubiertos aquí.